麻醉条件下线粒体基因编码电压指示器的开发与应用
基于遗传编码电压指示器（GEVIs）的线粒体靶向应用
背景与研究动机
线粒体，作为真核细胞的能量工厂，在多种细胞过程中起着重要作用，包括生物能量转换、代谢物合成、细胞存活、钙存储和热量产生等。在需要大量需氧代谢的器官中，如大脑和心脏，线粒体的正常功能尤为关键。维持神经元和心肌细胞的静息膜电位需要消耗大量能量，这主要通过钠钾泵（Na+/K+ ATP酶）实现。线粒体内膜包含载体、离子通道和离子泵，负责运输各种物质，从而产生并影响线粒体膜电位（MMP, ψm）。ψm与各种细胞生理相关，包括能量生产、反应性氧化物（ROS）形成、促进代谢底物和离子的跨膜运输等。此外，ψm还影响线粒体形态，参与线粒体吞噬和凋亡等过程。
当前测量线粒体膜电位（Δψm）的方法依赖于脂溶性阳离子染料的分布。然而，至今还没有针对MMP的遗传编码荧光指示器（GEVIs）。该研究尝试解决这一空白，旨在筛选和开发一种能靶向线粒体并监测其膜电位动态变化的GEVIs。
研究来源与作者信息
本文由Run-Zhou Yang、Dian-Dian Wang、Sen-Miao Li、Pei-Pei Liu和Jian-Sheng Kang等人撰写，研究机构包括郑州大学第一附属医院临床系统生物学实验室、郑州大学第一附属医院神经科和郑州大学医学院等。该研究在2024年发表在Neurosci. Bull.上。
研究流程与方法
研究对象与实验设计
研究首先选择了四种GEVIs，包括来源于GFP的Arclight、ASAP1和来源于视紫红质的Somoarchon和PROPS。这些GEVIs通过在其N端融合线粒体靶向信号序列（mt, 4cox8）来靶向线粒体。研究评估了这些GEVIs的线粒体靶向效率，并通过细胞实验验证其电压敏感性。
细胞培养与转染
实验使用了HEK293T、COS-7和HeLa细胞，这些细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，并在37°C、5% CO2/95%空气环境下生长。为了实现短期表达，采用钙磷沉淀法进行细胞转染。
细胞成像与共定位分析
通过激光扫描共聚焦显微镜进行成像，并利用ImageJ软件进行共定位分析，量化Pearson相关系数以评估线粒体靶向效率。
初级心肌细胞和神经元的分离与培养
实验使用0日龄C57BL小鼠的心脏和海马进行组织解剖，使用胰蛋白酶和胶原酶消化组织，并用抛光的细管进一步解离细胞后，种植在涂有基质凝胶的盖玻片上。心肌细胞在24小时后开始自主跳动，海马组织的细胞通过进一步解离并离心获得单细胞，之后种植并培养。
病毒制备与转导
利用腺相关病毒（AAV）和慢病毒来转导心肌细胞和神经元。病毒通过钙磷沉淀法转染HEK293T细胞制备，采用冻融循环方法提取病毒。
稳定转染细胞系的构建
通过慢病毒转导和后续筛选构建稳定转染的细胞系，细胞在含有噻呋辛的培养基中生长，并通过PCR和测序验证质粒序列的存在。
电生理和电压成像
在室温下进行全细胞膜片钳记录，使用定制的光电系统，数据采集率为10 kHz。通过电压钳模式记录细胞活动，并设定摄像头的触发模式捕获电压脉冲。
活细胞成像
在含有Tyrode缓冲液的荧光显微镜下对细胞成像，通过流模式采集图像。为了捕捉自发的电压波动，通过流模式获取图像。
in vitro筛选系统
在pcDNA3.1(-)载体中插入T5启动子和Shine-Dalgarno序列，以便在原核生物和哺乳动物细胞中表达。通过PCR和序列分析筛选高荧光的细菌克隆进行进一步分析。
实验结果
筛选与验证
在HeLa或COS-7细胞中，研究发现GEVIs中，mt-ASAP1展示了最高的线粒体靶向效率，并且显示出电压敏感性。此外，在心肌细胞中发现mt-ASAP1对ROS敏感。通过各种突变，研究开发了具有高电压敏感性并对ROS不敏感的突变体ASAP3-st。
线粒体膜电位的降低
在麻醉过程中，利用纤维光度法实验研究发现麻醉引起了线粒体去极化，其中mt-ASAP3-st能有效监测这种变化。
结论
该研究成功开发了四种可以靶向线粒体的GEVIs，并验证了其在多种细胞类型中的电压敏感性和ROS敏感性。研究结果有助于进一步理解线粒体在不同生理和病理过程中的作用，为治疗线粒体功能障碍的新药开发提供了高通量筛选工具。
研究亮点
- 开发了四种线粒体靶向的遗传编码电压指示器（MPI-1至MPI-4），并验证其在多种类型细胞中的应用。
- 发现并解决了mt-ASAP1在心肌细胞中对ROS敏感的问题，通过突变开发了对ROS不敏感的mt-ASAP3-st。
- 通过纤维光度法实验首次在体内监测到麻醉引起的线粒体膜电位去极化，为理解麻醉药物对线粒体功能的影响提供了新的视角。
研究意义
该研究不仅丰富了监测线粒体膜电位的工具，还为深入研究能量代谢相关的生理和病理过程提供了新的手段。这些GEVIs在药物筛选、疾病模型研究和基础生物学研究中具有广泛的潜在应用。