Conception d’un étiquette de détection universelle basée sur un aptamère d’ARN guidée par un ensemble de structures dynamiques artificielles

Contexte académique

Les molécules d’ARN jouent des rôles variés dans les systèmes biologiques naturels et synthétiques, leurs fonctions dépendant fortement de leurs structures tridimensionnelles dynamiques et spécifiques. Les structures secondaires et tertiaires de l’ARN, telles que les boucles, les pseudonœuds et les jonctions multiples, sont des “blocs de construction” clés pour comprendre le fonctionnement des éléments d’ARN. Cependant, la plupart des études sur les structures d’ARN se basent sur des structures statiques, alors que les processus médiés par l’ARN impliquent souvent des changements conformationnels. Ainsi, la description des ensembles de structures dynamiques peut capturer les modèles de conservation évolutive et faciliter leur conception étendue. Récemment, les aptamères d’ARN fluorogènes (fluorogenic RNA aptamer, FRAPT) ont fait des progrès significatifs dans les applications biologiques, mais leur conception manque d’une compréhension approfondie des ensembles de structures dynamiques et de principes de conception universels. Pour surmonter ces limitations, les chercheurs ont développé un ensemble de structures dynamiques d’ARN artificiel “SSPepper” et ont conçu une étiquette de détection biologique universelle basée sur l’ARN fluorogène “SSPepper-Apt”, utilisée pour l’imagerie en temps réel des métabolites et des protéines, et montrant une excellente compatibilité dans l’imagerie génomique et l’édition génique médiées par CRISPR.

Source de l’article

Cet article a été co-écrit par Jianing Hou, Pei Guo, Junyan Wang, Da Han et Weihong Tan, affiliés respectivement à l’Institut de médecine moléculaire de l’hôpital Renji de l’Université Jiao Tong de Shanghai et à l’Institut de médecine de Hangzhou de l’Académie chinoise des sciences. L’article a été publié le 20 décembre 2024 dans la revue PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences), sous le titre Artificial dynamic structure ensemble-guided rational design of a universal RNA aptamer–based sensing tag.

Processus de recherche

1. Conception et développement de l’ensemble de structures dynamiques d’ARN artificiel “SSPepper”

Pour développer un capteur FRAPT universel, les chercheurs ont choisi l’aptamère d’ARN fluorogène “Pepper” comme base, en raison de ses informations structurelles bien définies. En introduisant des mutations de motifs, les chercheurs ont créé un ensemble de structures dynamiques “SSPepper”, dont le paysage énergétique a été conçu pour inclure des conformations fluorescentes complexes. Les étapes de conception spécifiques sont les suivantes :

1. Établissement de la structure secondaire correcte : Sur la base de la structure à haute résolution du complexe Pepper-HBC, une structure secondaire correcte a été établie pour l’ensemble de structures dynamiques artificielles.
2. Ajustement de la stabilité de la boucle : Comme la région conservée de FRAPT (Pepper) qui se lie au fluorophore ne peut pas être modifiée, les chercheurs ont sélectionné des motifs représentatifs (hélice et boucle apicale) pour ajuster la proportion de conformations fluorescentes.
3. Introduction de tiges coulissantes : En modifiant la longueur des tiges coulissantes, la pertinence pour diverses applications d’imagerie cellulaire vivante a été améliorée.

Grâce à ces étapes, les chercheurs ont décomposé Pepper en trois régions : le domaine de régulation clé (bleu), l’élément moteur (jaune) et la séquence inchangée (gris). Le domaine de régulation clé est supposé initier des changements structurels au niveau du site de liaison HBC, tandis que l’hélice P1 non conservée de Pepper a été redessinée pour inclure des tiges coulissantes de différentes longueurs.

2. Caractérisation in vitro de SSPepper-Apt

Pour vérifier la portabilité, l’évolutivité et la composabilité de SSPepper-Apt, les chercheurs ont inséré de manière transparente les séquences centrales de divers éléments d’ARN liant des cibles, y compris l’aptamère de théophylline, l’aptamère GTP, l’aptamère ATP, le riboswitch guanine, le riboswitch SAM-III, l’ARN ciblant le peptide Tat du virus de l’immunodéficience bovine et l’aptamère de thrombine. À travers une série d’expériences, les chercheurs ont validé les performances de SSPepper-Apt pour différentes cibles et ont constaté qu’il présentait une large plage de fonctionnement dynamique et une excellente sélectivité.

3. Application de SSPepper-Apt dans les cellules vivantes

Les chercheurs ont ensuite appliqué SSPepper-Apt dans les cellules vivantes, surveillant avec succès les changements dynamiques de la théophylline et de la S-adénosylméthionine (SAM), et visualisant la localisation des peptides et des protéines. De plus, SSPepper-Apt a montré une excellente compatibilité avec le système CRISPR-Cas9, pouvant être utilisé pour prédire l’efficacité de l’édition génique.

Principaux résultats

1. Conception et développement de SSPepper : En introduisant des tiges coulissantes et des boucles de régulation, les chercheurs ont créé avec succès un ensemble de structures dynamiques “SSPepper”, dont la proportion de conformations fluorescentes peut être finement ajustée par la stabilité de la boucle.
2. Caractérisation in vitro de SSPepper-Apt : SSPepper-Apt a montré une large plage de fonctionnement dynamique et une excellente sélectivité pour différentes cibles, pouvant être utilisé pour détecter des métabolites, des peptides et des protéines.
3. Application de SSPepper-Apt dans les cellules vivantes : SSPepper-Apt a surveillé avec succès les changements dynamiques de la théophylline et de la SAM dans les cellules vivantes et a visualisé la localisation des peptides et des protéines. De plus, SSPepper-Apt a montré une excellente compatibilité avec le système CRISPR-Cas9, pouvant être utilisé pour prédire l’efficacité de l’édition génique.

Conclusion

En développant un ensemble de structures dynamiques d’ARN artificiel “SSPepper”, les chercheurs ont conçu avec succès une étiquette de détection biologique universelle basée sur l’ARN fluorogène “SSPepper-Apt”. Cette étiquette est évolutive, portable, composable et fiable, pouvant être utilisée pour l’imagerie en temps réel des métabolites et des protéines, et montrant une excellente compatibilité dans l’imagerie génomique et l’édition génique médiées par CRISPR. Cette recherche fournit une méthode universelle pour la construction de systèmes d’ARN fonctionnels, évitant le processus fastidieux de combinaison de séquences et élargissant la portée des outils de biologie synthétique.

Points forts de la recherche

1. Conception d’un ensemble de structures dynamiques : En introduisant des tiges coulissantes et des boucles de régulation, les chercheurs ont créé avec succès un ensemble de structures dynamiques “SSPepper”, dont la proportion de conformations fluorescentes peut être finement ajustée par la stabilité de la boucle.
2. Développement d’une étiquette de détection universelle : SSPepper-Apt a montré une large plage de fonctionnement dynamique et une excellente sélectivité, pouvant être utilisé pour détecter des métabolites, des peptides et des protéines.
3. Imagerie cellulaire vivante et édition génique : SSPepper-Apt a surveillé avec succès les changements dynamiques de la théophylline et de la SAM dans les cellules vivantes et a visualisé la localisation des peptides et des protéines. De plus, SSPepper-Apt a montré une excellente compatibilité avec le système CRISPR-Cas9, pouvant être utilisé pour prédire l’efficacité de l’édition génique.

Signification de la recherche

Cette recherche fournit une méthode universelle pour la construction de systèmes d’ARN fonctionnels, évitant le processus fastidieux de combinaison de séquences et élargissant la portée des outils de biologie synthétique. SSPepper-Apt a non seulement une valeur importante dans la recherche fondamentale, mais aussi un large potentiel d’application dans les domaines biomédicaux, tels que la surveillance en temps réel des métabolites intracellulaires, la localisation des protéines et la prédiction de l’efficacité de l’édition génique.