Imagerie efficace et hautement amplifiée des cibles d'acides nucléiques dans des échantillons cellulaires et histopathologiques avec PSABER

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Une nouvelle plateforme pour l’amplification efficace des signaux des cibles d’acides nucléiques dans la recherche sur les tissus et en clinique : PSABER

Contexte de la recherche et connaissances connexes

Depuis la première introduction de l’hybridation in situ (In Situ Hybridization, ISH) par Pardue et Gall dans les années 1960, cette technique a suscité un grand intérêt dans la recherche et les applications cliniques grâce à sa capacité à montrer visuellement la distribution spatiale des cibles d’acides nucléiques dans des échantillons fixés. L’ISH repose sur la réaction d’hybridation entre l’ARN ou l’ADN cible et une sonde complémentaire. Les résultats peuvent être analysés au moyen de la microscopie à fluorescence ou de la microscopie en lumière transmise. Cette méthode est largement utilisée pour la localisation de l’ADN génomique, l’analyse des caryotypes humains, la quantification de l’expression de l’ARN dans des cellules uniques ainsi que pour étudier l’organisation spatiale des chromosomes dans le noyau. En particulier, la technique d’hybridation in situ fluorescente (Fluorescent In Situ Hybridization, FISH) a bénéficié de la possibilité de marquage multiple des microscopes à fluorescence, permettant ainsi la visualisation simultanée de plusieurs transcrits d’ARN dans un seul échantillon.

Malgré des progrès constants, l’amélioration de la sensibilité du signal et l’extension de l’applicabilité restent un défi de taille. Cela est particulièrement essentiel pour des échantillons complexes comme les sections de tissus fixées et incluses en paraffine (FFPE). Les techniques actuelles d’amplification de signaux peuvent être grossièrement classées en deux catégories : les technologies basées sur l’assemblage (par exemple, l’amplification par ADN ramifié, la réaction en chaîne par hybridation) et les technologies enzymatiques (notamment celles utilisant la peroxydase de raifort (Horseradish Peroxidase, HRP) qui catalyse des dépôts localisés de signaux rapporteurs). Cependant, ces approches se heurtent souvent à des obstacles tels que des défis techniques, des coûts élevés ou une intégration difficile avec des méthodes cliniques. En 2019, Kishi et al. ont introduit la méthode SABER (Signal Amplification by Exchange Reaction), qui utilise des sondes étendues avec des sites spécifiques de liaison à des oligonucléotides pour former des concatémères d’ADN simple brin. Bien que SABER soit économique et relativement sensible, ses limites pour l’amplification des signaux et son absence de support pour la détection colorimétrique subsistaient.

Pour répondre à ces limitations, l’équipe de recherche a développé une nouvelle technique baptisée “PSABER” (Peroxidase SABER). Cette méthode complète et optimise SABER en intégrant la catalyse via l’enzyme HRP et en élargissant les applications de la détection colorimétrique et de fluorescence à des échantillons de tissus pathologiques.

Source de l’article et informations sur les auteurs

Cet article a été conduit par Sahar Attar, Valentino E. Browning, Mary Krebs et leurs collègues. Les auteurs sont principalement affiliés à diverses institutions de recherche de l’Université de Washington, telles que le Department of Genome Sciences, l’Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine et le Brotman Baty Institute for Precision Medicine. L’article a été publié dans le numéro de janvier 2025 de Nature Methods (Volume 22, pages 156-165), DOI : https://doi.org/10.1038/s41592-024-02512-2.

Détails précis de l’étude sur PSABER

Conception expérimentale et innovation technique

1. Aperçu du flux de travail expérimental

Le cœur de l’approche PSABER repose sur la création sur site (in situ) d’un site tandem de liaison qui peut recruter des oligonucléotides marqués avec HRP pour catalyser le dépôt localisé de substrats fluorescents ou colorimétriques. Les principales étapes sont les suivantes :

  • Extension des sondes : Les chercheurs ont utilisé une méthode de réaction d’extension de l’amorce (Primer Exchange Reaction, PER) qui allonge les sondes en ADN en concatémères contenant une séquence répétitive spécifique.
  • Hybridation aux échantillons : Les sondes cibles pour ADN ou ARN sont hybridées aux échantillons fixés ou FFPE.
  • Amplification par HRP : Les sondes hybridées sont liées à des oligonucléotides marqués avec HRP. L’ajout de H2O2 et de substrats appropriés catalyse le dépôt de signaux fluorescents ou colorimétriques.
  • Multiplexage par remplacement de solution : Grâce à des cycles d’échange de solutions, PSABER permet la détection multiplexée.

2. Validation des applications de la méthode

De nombreux cibles d’acides nucléiques ont été testées, notamment : 1. Le transcrit d’ARNm d’ADAMTS1. 2. Des séquences répétées satellites alpha sur l’ADN génomique. 3. La détection d’une région de 200 kb (Xp22.32) d’un chromosome humain. 4. Les séquences UMOD d’ARNm et l’ARNr 47S dans des échantillons FFPE de rein humain.

3. Détection multiplexée par échange de solution

Les chercheurs ont validé que PSABER peut supporter des cycles multiples de marquage. Dans des cellules fixées, PSABER a visualisé successivement les ARNs CBX5, 7SK et 47S en plusieurs tours de détection.

4. Compatibilité avec différents systèmes optiques

Les expériences ont également démontré que PSABER ne se limite pas à l’utilisation avec des microscopes avancés, mais peut également fournir des signaux clairs avec des systèmes optiques à faible ouverture numérique (NA) comme les objectifs de 10x et 20x.

Résultats expérimentaux et données à l’appui

Les résultats principaux de cette étude comprennent : 1. Amplification des signaux : Comparé au FISH conventionnel, PSABER a permis une amplification d’environ 25 fois des signaux pour la détection de l’ARN, et jusqu’à 70 fois avec des durées de réaction prolongées. 2. Fiabilité et adaptabilité : Des échantillons variés, y compris des tissus FFPE complexes, ont montré que PSABER fournit des signaux robustes avec des localisations spécifiques des cibles. 3. Clarté dans les images multiplexées : Les signaux amplifiés se distinguent clairement, même avec des équipements optiques standard et économes.

Portée et impact scientifique

La technologie PSABER ouvre la voie à des applications intéressantes en recherche fondamentale et en pratiques cliniques :

  1. Valeur scientifique : En augmentant considérablement la sensibilité dans les échantillons fixés, PSABER comble les lacunes des méthodes ISH existantes, en apportant une solution économique idéale aux environnements à ressources limitées.
  2. Applications cliniques : Dans les tissus FFPE, PSABER offre une alternative précieuse pour la localisation précise et très sensible des cibles d’ADN/ARN. Cela pourrait significativement améliorer les diagnostics de pathologies comme le cancer.

Points forts de l’étude

  1. Innover dans la technologie : PSABER intègre pour la première fois un support robuste pour la détection colorimétrique basée sur HRP.
  2. Amplification des signaux de haute sensibilité : Les signaux amplifiés permettent l’analyse sur des systèmes à faible résolution optique.
  3. Capacité au multiplexage : Les cycles d’échange permettent de détecter plusieurs cibles même avec des canaux optiques limités.
  4. Coût réduit : Par rapport aux méthodes commerciales, PSABER propose une alternative efficace sur le plan économique.

En conclusion, PSABER améliore considérablement la fiabilité des détections d’acides nucléiques et élargit les applications possibles dans les échantillons fixés. Cette innovation technologique constitue une avancée non seulement pour la recherche moléculaire, mais également pour la pratique diagnostique clinique grâce à sa flexibilité, son accessibilité et sa haute efficience.