Capteurs BRET Basés sur la Conformation et l'Activation Rapportent Différemment le Couplage GPCR-G Protéine

Biochimie Biophysique Sciences de la vie Médecine Biologie cellulaire
GPCR protéine G signalisation capteurs BRET changements conformationnels effecteurs en aval découverte de médicaments

Étude des différences des biosenseurs couplés aux protéines GPCR-G

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) sont des molécules importantes dans la transduction du signal à travers les membranes, capables de se lier sélectivement aux protéines G hétérotrimériques composées des sous-unités Gα, Gβ et Gγ, et de réguler divers processus de signalisation intracellulaire. Étudier la sélectivité fonctionnelle des GPCR est crucial pour comprendre leur fonction biologique et pour le développement de nouveaux médicaments. Cependant, le couplage sélectif des GPCR aux protéines G n’est pas toujours simple, et différents ligands peuvent orienter les récepteurs vers différents sous-types de la famille des protéines Gα. Pour explorer cette complexité, la technique de transfert d’énergie par résonance bioluminescente (BRET) est largement utilisée pour développer divers biosenseurs pour surveiller les interactions GPCR-protéine G. Cependant, différents types de biosenseurs BRET peuvent diverger dans la façon dont ils rapportent les événements de couplage.

Source de l’étude

Cette étude a été réalisée par Shane C. Wright et al., publiée le 18 juin 2024 dans “Science Signaling”. Les auteurs proviennent de différentes institutions de recherche, notamment l’Université de Montréal, l’Institut Karolinska, l’Université du Pays Basque, etc. L’équipe de recherche a comparé des biosenseurs BRET basés sur les changements conformationnels et l’état d’activation pour explorer leurs différences dans le rapport du couplage des protéines GPCR-G.

Processus de recherche

1. Méthodes de recherche et objets

Cette étude compare principalement deux types de biosenseurs BRET : le biosenseur Gαβγ basé sur les changements conformationnels et le biosenseur GEMTA basé sur l’état d’activation. Les objets de l’étude incluent divers GPCRs, tels que les récepteurs 5-HT2A et 5-HT7, le récepteur du GLP-1 (GLP-1R) ainsi que le récepteur muscarinique M3. Ces récepteurs sont exprimés dans des cellules cultivées et leur couplage à des protéines Gα spécifiques est surveillé à l’aide de différents biosenseurs BRET.

2. Conception expérimentale

  • Biosenseur Gαβγ : En co-exprimant la sous-unité Gα étiquetée avec la luciférase de Renilla (Rluc), la sous-unité Gβ non marquée et la sous-unité Gγ étiquetée avec la protéine fluorescente verte (GFP), on surveille les changements conformationnels du trimère de protéines G. Après ajout de l’agoniste, l’activation du récepteur entraîne la dissociation des sous-unités Gγ et Gβ de la sous-unité Gα-Rluc, ce qui fait diminuer le signal BRET.
  • Biosenseur GEMTA : En utilisant des protéines effectrices de G-protéines modifiées (comme Rap1GAP1a et P63RhoGEF) liées à Rluc et à une protéine GFP ancrée dans la membrane, on surveille l’état d’activation de la sous-unité Gα après activation du récepteur, ce qui se manifeste par une augmentation du signal BRET.

3. Analyse des données

En comparant les réponses de différents biosenseurs BRET dans la détection du couplage des GPCR-protéines G, on a évalué l’impact du choix du biosenseur, de la construction du récepteur et du choix des sous-unités Gβγ sur les résultats expérimentaux.

Résultats principaux

1. Le choix du biosenseur influence la détermination du couplage des GPCR-protéines G

  • Le biosenseur Gαβγ a montré un couplage sélectif de Gαs en détectant le couplage du récepteur 5-HT7 aux protéines Gα, tandis que le biosenseur GEMTA a détecté une activation plus large des Gαi/o et Gαq/11, indiquant que le biosenseur GEMTA a une sensibilité et une robustesse plus élevées.
  • En utilisant des sous-unités Gαi1 mutées, on a encore validé la capacité du biosenseur GEMTA à détecter les membres actifs de la famille Gαi/o.

2. La modification des récepteurs influence la détermination du spectre de couplage

  • L’étude a révélé que les récepteurs 5-HT2A portant une étiquette N-terminale de 3×HA avaient une capacité de couplage plus faible aux membres de la famille Gαi/o, tandis que les récepteurs 5-HT2A non marqués pouvaient activer tous les membres de la famille Gαi/o. Cela suggère que le choix de la construction des récepteurs doit être pris en compte dans la conception expérimentale, et que les récepteurs non marqués devraient être privilégiés.

3. Le choix des sous-unités Gβγ influence l’activation des sous-unités Gα

  • En comparant le choix de différentes combinaisons de Gβγ, on a constaté que différentes combinaisons de sous-unités Gβγ avaient un impact significatif sur la réponse de Gαq. Par exemple, pour le GLP-1R, la combinaison Gβ2γ8 a produit la réponse la plus élevée lors du couplage à Gαq, plutôt que la combinaison Gβ3γ9 habituellement utilisée.

Conclusion et signification

Cette étude montre que différents types de biosenseurs BRET peuvent produire des différences dans le rapport des événements de couplage des GPCR-protéines G. Le biosenseur GEMTA, en raison de la préservation de la structure native des protéines et de son rapport signal/bruit élevé, est capable de détecter une gamme plus large d’événements d’activation des protéines G, tandis que le biosenseur Gαβγ peut avoir des limitations dans la détection des événements de couplage plus faibles. De plus, la modification des récepteurs et le choix des sous-unités Gβγ ont également un impact significatif sur les résultats expérimentaux.

Cette étude souligne l’importance de choisir soigneusement les biosenseurs dans la conception expérimentale et, dans la mesure du possible, d’utiliser des récepteurs non modifiés et des combinaisons de protéines G. Comprendre ces différences est crucial pour traduire les observations in vitro en conclusions physiologiquement pertinentes. Les recherches futures devraient utiliser plusieurs plateformes pour vérifier la signification physiologique des couplages GPCR-protéines G.

Points forts de l’étude

  • Importance du choix du biosenseur : Différents types de biosenseurs BRET présentent différentes sensibilités et sélectivités dans la détection des couplages GPCR-protéines G.
  • Impact de la modification des récepteurs : Les récepteurs marqués peuvent altérer leur spectre de couplage, les récepteurs non marqués devant être préférés.
  • Rôle du choix des sous-unités Gβγ : La sélection des combinaisons spécifiques de Gβγ a un impact significatif sur l’activation des protéines G, différents récepteurs pouvant nécessiter différentes combinaisons de Gβγ.

Autres informations utiles

L’équipe de recherche suggère que dans les futures études, une utilisation combinée de divers types de biosenseurs BRET est nécessaire pour comprendre pleinement la complexité du couplage des GPCR-protéines G. De plus, il est nécessaire de vérifier davantage la pertinence physiologique des événements de couplage observés in vitro, afin de progresser dans la découverte et le développement de médicaments.