MALDIイメージングと2光子顕微鏡を組み合わせた結腸直腸癌の異質性における局所的な差異の解明
大腸癌腫瘍微小環境の多モーダルイメージング研究：空間的異質性の解明
学術的背景
大腸癌（Colorectal Cancer, CRC）は、世界的にがん関連死亡の主要な原因の一つであり、その複雑性と異質性により治療と予後予測が非常に困難となっています。腫瘍微小環境（Tumor Microenvironment, TME）は、がんの進行、転移、治療反応において重要な役割を果たしており、特に細胞外マトリックス（Extracellular Matrix, ECM）中のコラーゲン（collagen）が腫瘍の病理生理学に大きな影響を与えています。しかし、従来の組織学、大腸内視鏡検査、分子スクリーニングなどの方法では、腫瘍組織の空間的複雑性、例えばがんプロテオーム、コラーゲン構造、細胞核分布の相互作用などを完全に特徴付けることができませんでした。
大腸癌の異質性をより深く理解するために、本研究では、二光子レーザー走査顕微鏡（Two-Photon Laser Scanning Microscopy, 2PLSM）、組織学、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging, MALDI-MSI）を組み合わせた多モーダルイメージング戦略を提案し、大腸癌腫瘍微小環境の空間的異質性を解明しました。この研究では、コラーゲン繊維の構造的一貫性と腫瘍組織の細胞核分布特性をペプチド特性と関連付けることで、大腸癌の病理生理学に新たな知見を提供しています。
論文の出典
本論文は、ドイツのマックス・プランク多分野科学研究所（Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences）、ゲッティンゲン大学医学センター病理学研究所（Institute of Pathology, University Medical Center Göttingen）、およびベルリン健康研究所（Berlin Institute of Health）の研究チームによって共同で行われました。主な著者には、Bharti Arora、Ajinkya Kulkarni、Andrea M. Markusなどが含まれます。論文は2024年に「npj Imaging」誌に掲載されました。
研究の流れ
1. サンプルの収集と処理
研究には、14例の大腸癌患者から切除された腫瘍組織サンプルが含まれており、サンプルの解剖学的部位、腫瘍ステージ、形態学的特性が詳細に記録されました。すべてのサンプルは、ゲッティンゲン大学医学センターの倫理委員会の承認と規定に従って収集および使用されました。
2. ラベルフリーイメージング
二光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を使用して組織切片をイメージングし、コラーゲン繊維が生成する第二高調波信号（Second Harmonic Generation, SHG）と組織の二光子励起自己蛍光信号（Two-Photon Excitation Autofluorescence, 2PEF）を捕捉しました。これらの信号により、研究者は外部の蛍光染料を使用せずに、サブミクロンの解像度で組織内のコラーゲン繊維構造を可視化することができました。
3. MALDI-MSIサンプル調製
組織サンプルは固定され、パラフィン包埋された後、5マイクロメートルの厚さにスライスされ、導電性ガラススライドに取り付けられました。2PLSMイメージング後、サンプルはMALDI-MSI分析に供されました。サンプルは脱パラフィン化、抗原修復、トリプシン消化を経て、MALDI-MSIイメージングが行われました。
4. MALDI-MSIイメージング
Bruker Daltonik GmbHのRapiflex® MALDI TissueTyper®を使用してMALDI-MSIイメージングを行い、800-3200 m/zの範囲で検出し、各スポットで500回のレーザーショットを行い、サンプリングレートは1.25 GS/s、ラスター幅は50マイクロメートルでした。
5. タンパク質同定
ナノ液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（nano-LC-ESI-MS/MS）を使用して、隣接する組織切片のタンパク質同定を行いました。ペプチドはC18カラムで分離され、質量分析計で検出されました。ペプチド同定は、ヒトSwiss-Protデータベースを使用して行われました。
6. 組織学分析
MALDI-MSIイメージング後、組織切片はヘマトキシリンとエオシン（H&E）染色を行い、全スライドスキャナーでスキャンされました。H&E画像は、QuPathソフトウェアを使用して腫瘍領域を注釈するために使用されました。
7. 画像処理
2PLSM画像からSHG信号を抽出し、テクスチャ分析を行い、コラーゲン繊維の一貫性を示すヒートマップを生成しました。H&E画像から細胞核をセグメンテーションし、細胞核分布のヒートマップを生成しました。これらのヒートマップは、異なる領域のプロテオーム特性をさらに分析するために使用されました。
主な結果
1. 左側および右側大腸癌のプロテオーム特性の違い
MALDI-MSIデータの単変量解析により、左側および右側大腸癌（LSCCとRSCC）腫瘍組織間に差異のあるペプチドが発見されました。520のm/zピークが特定され、そのうち203のm/z値が83のタンパク質に対応していました。受信者操作特性分析（ROC）により、LSCCとRSCCの間に有意な差異を示す76のm/z値が特定されました。
2. 高細胞核分布領域のプロテオーム特性
研究により、高細胞核分布（HND）領域がLSCCとRSCC組織において、低細胞核分布（LND）領域よりも有意に少ない面積を占めることが明らかになりました。ROC分析により、HNDとLND領域間に有意な差異を示す14のm/z値が特定され、これらのm/z値は7つのタンパク質に対応していました。
3. コラーゲン繊維組織のプロテオーム特性
2PLSM分析により、LSCCとRSCC腫瘍組織において、混沌としたコラーゲン領域の割合が秩序だった領域よりも有意に高いことが明らかになりました。MALDI-MSIデータのROC分析により、LSCCとRSCCの混沌としたコラーゲン領域間に有意な差異を示す43のm/z値が特定され、これらのm/z値は19のタンパク質に対応していました。
結論
本研究では、2PLSM、組織学、MALDI-MSIを組み合わせた新しい多モーダルイメージング手法を開発し、大腸癌腫瘍微小環境の空間的異質性を特徴付けることができました。LSCC、RSCC、および健康組織中のペプチドとイメージング特性を定量化し、腫瘍微小環境の異質性を明らかにし、LSCCとRSCCの異なる領域におけるペプチド特性を区別しました。この研究は、大腸癌の進行、転移、治療反応を理解するための新たな視点を提供し、将来の新しい治療ターゲットの開発の基盤を築きました。
研究のハイライト
- 多モーダルイメージング戦略：初めて2PLSM、組織学、MALDI-MSIを組み合わせ、大腸癌腫瘍微小環境の空間的異質性を包括的に特徴付けました。
- プロテオーム特性の違い：LSCCとRSCC腫瘍組織間のプロテオーム特性の違いを明らかにし、個別化治療の潜在的なターゲットを提供しました。
- コラーゲン繊維構造の影響：コラーゲン繊維の組織構造が腫瘍の病理生理学において重要な役割を果たすことを示し、将来の研究に新たな方向性を提供しました。
研究の意義
この研究は、大腸癌の病理生理学に新たな知見を提供するだけでなく、腫瘍微小環境に基づく個別化治療戦略の開発の基盤を築きました。複数のイメージング技術を組み合わせることで、研究者は腫瘍の異質性をより包括的に理解し、臨床診断と治療により正確なガイダンスを提供することが可能となりました。