BOKタンパク質のカルシウムシグナル調節における新たな役割

背景紹介

BOK（Bcl-2-related ovarian killer）は、Bcl-2タンパク質ファミリーの一員であり、長い間細胞死（アポトーシス）において役割を果たすと考えられてきました。しかし、近年の研究により、BOKは非アポトーシス機能、特にカルシウムイオン（Ca²⁺）シグナル調節においても重要な役割を果たす可能性が示されています。カルシウムイオンは細胞内の重要な第二メッセンジャーであり、細胞増殖、分化、アポトーシスなど多様な細胞プロセスに関与しています。小胞体（ER）は細胞内の主要なカルシウムイオン貯蔵庫であり、IP3受容体（IP3R）は小胞体からのカルシウムイオン放出を調節する重要なチャネルです。BOKとIP3Rの結合は確認されていますが、IP3R機能への直接的な影響はまだ明確ではありません。さらに、BOKのセリン-8（Ser-8）部位は高度に保存されたリン酸化部位ですが、その機能的な意義は十分に研究されていません。

本研究の目的は、BOKおよびそのリン酸化がIP3Rを介したカルシウムイオン放出をどのように調節するかを探ること、特にSer-8部位のリン酸化がBOKとIP3Rの相互作用およびカルシウムシグナルにどのような影響を与えるかを明らかにすることです。

論文の出典

本論文は、Caden G. Bonzerato、Katherine R. Keller、およびRichard J. H. Wojcikiewiczによって共同執筆され、彼らはすべてSUNY Upstate Medical Universityの薬理学部門に所属しています。論文は2025年にCell Communication and Signaling誌に掲載され、タイトルは《Phosphorylation of BOK at Ser-8 blocks its ability to suppress IP3R-mediated calcium mobilization》です。

研究の流れと結果

1. BOKのリン酸化研究

実験の流れ

• 体外リン酸化実験：研究者は、細菌で発現させたHis-SUMOタグ付きBOKタンパク質（HS-BOKδTM）を使用し、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）を用いて体外でリン酸化反応を行いました。質量分析（MS）により、Ser-8部位のリン酸化を確認しました。
• 体内リン酸化実験：αT3細胞において、PKA活性化剤（forskolinなど）およびホスファターゼ阻害剤（calyculin Aなど）を用いて細胞を処理し、ウェスタンブロット（Western blot）および免疫共沈降（Co-IP）技術を用いてBOKのリン酸化状態を検出しました。

結果

• 体外実験：質量分析により、BOKのSer-8部位がPKAによってリン酸化されることが確認され、リン酸化後はBOKとIP3R1の結合能力が著しく低下しました。
• 体内実験：αT3細胞において、PKA活性化剤はBOKのリン酸化レベルを有意に増加させ、リン酸化BOKはIP3R1との結合能力が低下しました。

2. BOKによるIP3R1を介したカルシウムイオン放出の調節

実験の流れ

• カルシウムイオン濃度測定：研究者は、蛍光カルシウム色素（Calcium 6など）および遺伝子コード化カルシウムセンサー（R-CEPIA1erなど）を使用して、細胞内カルシウムイオン濃度（[Ca²⁺]c）および小胞体カルシウムイオン濃度（[Ca²⁺]er）を測定しました。
• 細胞モデル：研究では、HEK-3KO細胞（すべてのIP3Rサブタイプを欠く）およびHEK-IP3R1細胞（IP3R1のみを発現）、さらにαT3細胞およびSH-SY5Y細胞（主にIP3R1を発現）など、多様な細胞モデルを使用しました。

結果

• BOKによるカルシウムイオン放出の抑制：HEK-IP3R1細胞において、BOKはGタンパク質共役型受容体（GPCR）誘導性のカルシウムイオン放出後の[Ca²⁺]cの減少を著しく加速しました。この効果は、BOKとIP3R1の結合に依存しており、BOKを結合しないIP3R変異体では同様の効果は観察されませんでした。
• リン酸化によるBOK機能の調節：BOKのSer-8部位がリン酸化されるか、リン酸化模倣変異体（S8E）に置換されると、BOKによるIP3R1を介したカルシウムイオン放出の抑制効果が逆転しました。

3. BOKとIP3R1の相互作用メカニズム

実験の流れ

• 免疫共沈降実験：研究者は、Co-IP技術を用いてBOKとIP3R1の結合能力を検出し、リン酸化が結合に及ぼす影響を分析しました。
• 小胞体カルシウムイオン漏出実験：thapsigargin（TG）を使用して小胞体カルシウムポンプ（SERCA）を阻害し、カルシウムイオン漏出速度を測定しました。

結果

• リン酸化によるBOKとIP3R1の結合の弱化：リン酸化BOKまたはS8E変異体は、IP3R1との結合能力が著しく低下し、Ser-8リン酸化がBOKとIP3R1の相互作用を弱めることでカルシウムイオン放出を調節することが示されました。
• BOKによる小胞体カルシウムイオン漏出の抑制：BOKはIP3R1依存性の小胞体カルシウムイオン漏出を著しく抑制しましたが、リン酸化BOKまたはS8E変異体はこの抑制効果を失いました。

結論と意義

本研究は、BOKがSer-8部位のリン酸化を介してIP3R1を介したカルシウムイオン放出を調節することを初めて明らかにしました。具体的には、BOKはIP3R1との結合によりカルシウムイオン放出を抑制し、Ser-8リン酸化はこの抑制効果を弱めます。この発見は、BOKのカルシウムシグナル調節における機能を拡張するだけでなく、Bcl-2ファミリータンパク質の非アポトーシス過程における役割を理解するための新たな視点を提供します。

研究のハイライト

1. BOKの新機能：BOKがIP3R1活性を調節することでカルシウムイオン放出に影響を与えることを初めて証明し、カルシウムシグナル調節における非アポトーシス機能を明らかにしました。
2. リン酸化の調節メカニズム：Ser-8リン酸化はBOKとIP3R1の結合を弱めることで、BOKによるカルシウムイオン放出の抑制効果を逆転させます。
3. 細胞モデルの多様性：研究では多様な細胞モデルを使用し、結果の広範な適用性を確保しました。

応用価値

本研究の結果は、カルシウムシグナル経路に関連する疾患の治療戦略を開発するための新たなターゲットを提供します。例えば、BOKのリン酸化状態を調節することで、神経変性疾患や心血管疾患など、カルシウムシグナルの調節異常に関連する疾患の治療に役立つ可能性があります。

その他の価値ある情報

• 技術革新：研究で使用された高感度質量分析および遺伝子コード化カルシウムセンサーは、将来のカルシウムシグナル研究に強力なツールを提供します。
• 学際的協力：本研究は分子生物学、細胞生物学、生化学などの多分野の技術を組み合わせており、複雑な生物学的问题を解決するための学際的研究の重要性を示しています。