行動中の動物におけるニューロンの高速形態ダイナミクスの超解像イメージング

神経内科学 生命科学 医用画像学 医学 生物物理学
超解像イメージング ニューロン形態ダイナミクス 行動中の動物 構造化照明顕微鏡 神経可塑性

覚醒状態の固定されたマウス脳における神経形態動態の超解像イメージングの新展開：動的観測の実現

背景説明

神経科学研究の分野において、神経細胞の形態変化およびその機能的動態は、脳の情報処理やネットワーク可塑性を理解する鍵となる課題です。しかし、樹状突起スパイン（dendritic spines）、軸索終末（axonal boutons）、およびそれらを結ぶシナプス構造が動物の学習や行動適応に重要な役割を果たしているものの、これらの構造を生体内で動的に観察するのは依然として大きな挑戦となっています。従来の顕微鏡イメージング手法は解像度および撮影速度に制限があるため、神経細胞の微細構造に関する多くの研究が固定された組織や培養細胞のレベルにとどまっており、可塑的変化が自然な行動や生理状態とどのように関係するかを理解するには限界がありました。

近年、超解像顕微鏡（super-resolution microscopy, SRM）の導入により、従来の光学イメージングの回折限界が突破され、神経ネットワークの微細な構造と生体内の動的行動の研究間のギャップが縮まりました。しかし、生体動物の運動アーティファクトやイメージング速度の制限により、覚醒中の動物における超解像イメージングの適用は依然として困難を極めています。一部の研究では、麻酔を使用してアーティファクトを減らし、刺激減退発光顕微鏡（STED）を用いて麻酔下のマウス脳を観察する試みが行われていますが、麻酔状態は神経系の通常の生理機能を変化させるため、動物の自然な行動状態での真の神経動態を反映することができません。

このような背景の下、中国科学院脳科学と知能技術卓越革新センターおよび上海科技大学のYujie Zhangらの研究チームは、複数ラインスキャン構造化照明顕微鏡（multiplexed, line-scanning structured illumination microscopy, MLS-SIM）と呼ばれる新技術を開発し、これらの課題を解決しようとしました。この革新的技術は、頭部が固定された状態で覚醒動物における超解像顕微鏡技術の応用に新たな可能性を開きました。

論文情報

この研究論文のタイトルは「Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals」であり、著者にはYujie Zhang、Lu Bai、およびKai Wangらが含まれています。彼らは中国科学院脳科学と知能技術卓越革新センターおよび上海科技大学生命科学および技術学院といった機関に所属しています。この論文はNature Methodsに掲載され（doi: https://doi.org/10.1038/s41592-024-02535-9）、2025年1月の《Nature Methods》第22巻に収録されています。

研究フローと手法

被験体と実験設計の概要

研究チームの主な目標は、頭部固定状態の覚醒動物で長期間の縦断的超解像イメージングを実現する新しい手法を開発し、その手法を用いて樹状スパインおよび軸索終末の動態を研究することでした。実験は主に技術開発、解像度の評価、および多次元的応用という三つのパートで構成されました。

  1. MLS-SIM技術の開発
    MLS-SIMは、従来の構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy, SIM）の利点を取り入れつつ、いくつかの革新を追加した技術です。この技術は、2種類の独特なラインスキャン励起モードを採用し、それぞれのモードが特定方向の解像度を向上させつつ、背景光の排除と高速サンプリングを実現しています。この多モードスキャンに対応するため、著者は新しい再構成アルゴリズムを設計し、生の低解像度データを効果的にデコンボリューションして最終的な高解像度画像を生成しています。

  2. 解像度および動き耐性の評価
    著者は、膜標識された強化型緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用い、モデル動物（ゼブラフィッシュおよびマウス）のプルキンエ細胞を標識して測定を行いました。その結果、MLS-SIMの横方向（約150ナノメートル）および軸方向（約450ナノメートル）の解像度が高いことを示しました。また、異なる運動速度（最大100 μm/sを含む）および信号対雑音比条件でテストしたところ、この方法が運動アーティファクトに対して高い耐性を示しました。

  3. 頭部固定状態の覚醒マウスでの応用
    医学的応用価値を検証するため、研究チームは睡眠-覚醒サイクル中のマウス脳内イメージングを実施し、樹状スパインおよび軸索終末の形態変化を観察しました。さらに、二色イメージングを介して、シナプス後膜タンパク質PSD-95（シナプスの成熟を示す標識として一般的に使用される）のサブ構造と神経形態学の相関を調査しました。

データ再構成とアルゴリズムの革新

MLS-SIMの画像再構成は、多層結合デコンボリューションアルゴリズムに基づいており、特に異なるスキャンモードで得られる点拡散関数（PSFs）に対応するよう最適化されています。研究チームは、各2次元画像を複数のグループに分割し、異なる有効PSFsに基づきイメージング層を再構成しました。最終的に、多層3D合成によって完全な高解像度画像を生成しました。既存の方法と比較して、MLS-SIMの設計により、1フレームあたりの必要サンプリング数が大幅に減少し、その結果、運動耐性が向上しました。

研究結果とデータ解析

  1. 解像度および動き耐性

    • 静的なサンプルにおける試験では、MLS-SIMの横方向解像度は120-150ナノメートルと測定され、既存のSIM手法と同等でした。
    • 動的試験では、運動耐性の優れた成果を達成しました：サンプルが50 μm/sで運動しても100ナノメートルレベルの解像度を維持しました。また、運動速度100 μm/sでも、運動方向に直交する方向では静的条件に近い解像度が保たれました。

  2. 神経形態学動態の観察

    • 樹状スパイン：20分間以上にわたる時間経過画像を通じて、62%の樹状スパインが動的にスピヌール（spinules）を生成する様子が観察されました。これらのスピヌールはサイズが小さく、探索範囲は約1 μmで、大部分が短命でしたが、その寿命と正の相関が見られました。
    • 軸索終末：樹状スパインに加え、興奮性軸索終末のイメージングでは、47%の亜構造にスピヌールに似た小型突起が存在することが確認され、一部は秒単位の動的変化を示しました。

  3. PSD-95二色イメージング

    • PSD-95タンパク質の分布形態はシンプルな点状から複雑な多領域構造まで非常に多様であり、主に枝幹樹状突起基部や樹状スパイン内に分布していました。30分間の観察中、PSD-95の配置点の75%以上が小型突起形態と強い関連を持っていることが確認されました。これらの相互作用は、樹状スパインの形成およびシナプス成熟の重要なメカニズムである可能性が示唆されています。

  4. 睡眠-覚醒サイクルの動態

    • 脳波（EEG）および筋電図（EMG）をモニタリングすることで、速波睡眠および非速波睡眠中のマウス脳における樹状突起および軸索の形態変化が捉えられました。結果として、睡眠状態は樹状スパインの面積変化を顕著に引き起こすことはありませんでしたが、特定の時間周期内でスピヌールの数が変動することが判明しました。このことは、睡眠がシナプス可塑性に特定のパターンで影響する可能性を示唆しています。

推論と示唆

  1. 科学的意義：
    MLS-SIMは、覚醒状態にある動物の神経細胞形態学を高精度でイメージングすることを可能にし、自然な行動環境下での脳の可塑性変化を解析できる道を切り開きました。この結果は、超解像技術が神経科学における応用と理論的知識を結びつける上で重要なブレークスルーとなりました。

  2. 技術的価値：
    従来の超解像技術は覚醒動物の運動アーティファクトおよび低信号対雑音比により制約を受けていましたが、MLS-SIMは革新的な光学設計およびアルゴリズムによって、安定性と解像度の両方を実現しました。

  3. 新規発見：
    動的観測により、小型突起（スピヌール）が秒単位で迅速に形成および消退し、PSD-95のサブ構造と関連する様子が明らかになりました。この動態は、シナプスの成熟、切断、および脳ネットワーク可塑性と密接に関係していると考えられています。

  4. 将来的な応用：
    神経科学以外でも、MLS-SIMは心臓の拍動や肺呼吸のような動的構造研究に広く応用できる可能性があり、将来の医療診断や組織工学研究に新しいツールを提供することが期待されます。

総括

この研究は、MLS-SIMが覚醒状態の固定されたマウスにおける超解像イメージングの成功例を示しただけでなく、神経構造と分子動態の関連性を深く解明しました。MLS-SIMは革新的ツールとして、将来の研究計画を理論的に支えるだけでなく、特に神経ネットワークがどのように行動や記憶のメカニズムを制御するかを探る上で深い影響をもたらす可能性を持っています。