老化した筋芽細胞は、老化関連分泌表現型シグナル伝達に関連する変更されたエクソメタボロームを示す

2025-02-23 Sun
老化筋芽細胞のメタボローム変化に関するレポート研究背景年齢を重ねるにつれて、骨格筋の機能は徐々に低下します。この現象は、筋肉幹細胞（サテライトセル）の老化と密接に関連しています。サテライトセルは筋肉損傷修復において重要な役割を果たしますが、老化の過程でこれらの細胞の機能は徐々に失われ、筋肉の再生能力が低下します。近年、科学者たちは、細胞老化が単に細胞周期の永久停止を示すだけでなく、「老化関連分泌表現型」（SASP, Senescence-Associated Secretory Phenotype）と呼ばれる現象も伴うことを発見しました。SASPとは、老化細胞が大量の代謝物やサイトカインを放出し、これらの物質が周囲の細胞や組織に悪影響を与える可能性があることです。しかし、特に外代謝産物（exometabolome）における老化骨格筋細胞のメタボローム変化に関する研究は非常に限られています。そこで、本研究では、老化筋芽細胞のメタボローム変化、特にその外代謝産物の特徴を調査し、これらの変化とSASPシグナルとの関係を研究することを目的としています。
論文出典本研究はMichael Kamal、Meera Shanmuganathan、Zachery Kroezen、Sophie Joanisse、Philip Britz-McKibbin、Gianni Pariseによって共同で行われました。研究チームは、カナダ・マクマスター大学の運動代謝研究グループ、化学および化学生物学科、そして英国ノッティンガム大学生命科学部から参加しました。この論文は2024年12月27日に『American Journal of Physiology-Cell Physiology』誌に初めて掲載され、DOIは10.1152/ajpcell.00880.2024です。
研究手順1. 細胞培養と老化誘導研究では、実験対象としてC2C12筋芽細胞を使用しました。これらの細胞はAmerican Type Culture Collectionから取得され、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地で培養されました。細胞老化を誘導するために、研究者たちはDNA二本鎖切断を引き起こす抗がん剤であるブレオマイシン（bleomycin）を使用して細胞を処理しました。ブレオマイシンは細胞老化を効果的に誘導できることが証明されています。細胞が50〜60%融合した時点で、ブレオマイシンまたは対照溶媒（DMSO）で12時間処理し、その後細胞を洗浄し新鮮な培地に交換し、24時間後に細胞と培地を収集して後続の分析を行いました。
2. メタボローム解析研究者たちは、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）を使用して、細胞および培地中の代謝物について非標的メタボローム解析を行いました。具体的なステップには以下が含まれます：

- サンプル前処理：細胞および培地サンプルを氷上でゆっくり解凍し、内標準物質を含むメタノール/水混合液を添加し、渦巻き混合後遠心し、上清を採取して分析しました。

- 代謝物の分離と検出：Agilent 6230飛行時間型質量分析計（TOF-MS）とAgilent G7100Aキャピラリー電気泳動装置を使用して代謝物の分離と検出を行いました。分析条件には、極性代謝物の正イオンモードおよび負イオンモードでの解析、ならびに非エステル化脂肪酸の負イオンモードでの解析が含まれます。

- データ解析：MetaboAnalyst 6.0ソフトウェアを使用して主成分分析（PCA）、階層的クラスタリング分析（HCA）、および遺伝子-代謝物相互作用ネットワーク分析などのデータ処理と統計分析を行いました。
3. 代謝物の用量反応実験研究者たちは、老化細胞の培地中で顕著に増加した4つの代謝物を選んでさらなる実験を行い、トリメチルアミン-N-オキシド（TMAO）、キサンチン（xanthine）、コリン（choline）、オレイン酸（oleic acid）を選びました。これらの代謝物はそれぞれ生理的濃度（1×）および超生理的濃度（10×）で健康な筋芽細胞を処理し、細胞老化マーカーおよびSASP遺伝子発現への影響を評価しました。

- 老化マーカーの検出：老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）染色、細胞増殖試験（MTT法）、p53およびp21タンパク質発現の検出、ならびにγ-H2AXタンパク質発現の検出により、代謝物が細胞老化に与える影響を評価しました。

- SASP遺伝子発現の検出：リアルタイム定量PCR（qPCR）を使用して、Ccl2、Cxcl12、Il33、Cyr61などのSASP関連遺伝子の発現レベルを測定しました。
4. 遺伝子-代謝物相互作用ネットワーク分析代謝物と老化遺伝子の関係をさらに探るために、研究者たちはSenMayo遺伝子セット（多様な組織や種における細胞老化に関連する遺伝子を含むデータベース）を使用して解析を行いました。Cytoscapeソフトウェアを使用して遺伝子-代謝物相互作用ネットワークを構築し、老化遺伝子と高度に関連する代謝物をスクリーニングしました。
主要な結果1. 老化筋芽細胞の外代謝産物の顕著な変化CE-MS解析により、老化筋芽細胞の外代謝産物に顕著な変化があることがわかり、老化細胞の培地中で40種類の代謝物が有意に増加していることが判明しました。主に非エステル化脂肪酸やアミノ酸代謝産物が含まれています。その中でも、オレイン酸、アラキドン酸、パルミチン酸などの脂肪酸の放出量が大幅に増加していました。また、細胞内のメタボロームの変化は比較的小さく、アラキドン酸やチロシンなど少数の代謝物のみが有意に増加していました。
2. 代謝物による細胞老化への影響用量反応実験によると、TMAO、キサンチン、コリン、またはオレイン酸を単独で処理しても、細胞老化を有意に誘導することはできませんでした。オレイン酸処理はp53 mRNA発現を上昇させましたが、他の老化マーカーであるSA-β-gal活性やp21タンパク質発現などには顕著な変化はありませんでした。さらに、オレイン酸処理はCcl2、Cxcl12、Il33などのSASP遺伝子の発現を有意に上昇させ、オレイン酸がSASPシグナル制御において機能する可能性があることを示唆しました。
3. オレイン酸と老化遺伝子の関連遺伝子-代謝物相互作用ネットワーク解析では、オレイン酸がIL8、MMP9、EDN1などの複数の老化遺伝子と高度に関連していることが明らかになりました。これらの遺伝子はSASPシグナル経路において重要な役割を果たしており、オレイン酸がこれらの遺伝子発現に影響を与えてSASPを制御する可能性があることを示唆しています。
研究結論本研究では、初めて系統的に老化筋芽細胞の外代謝産物変化を解析し、老化細胞が大量の非エステル化脂肪酸、特にオレイン酸を放出することを発見しました。これは、SASPシグナル制御において重要な役割を果たしている可能性があります。これらの代謝物は単独では細胞老化を誘導できませんが、SASP関連遺伝子の発現に影響を与えることで間接的に老化細胞の微小環境を制御している可能性があります。この発見は、骨格筋老化の分子メカニズムの理解を深め、将来の老化関連疾患治療戦略の開発に新しい視点を提供します。
研究のハイライト外代謝産物特性の初の系統的解析：本研究では、初めて詳細に老化筋芽細胞の外代謝産物変化を記述し、老化プロセスにおける非エステル化脂肪酸の重要な役割を明らかにしました。

オレイン酸の潜在的な制御作用：オレイン酸が複数のSASP関連遺伝子の発現を有意に上昇させることを発見し、それがSASPシグナル制御における潜在的な役割を持つことを示唆しました。

遺伝子-代謝物相互作用ネットワークの構築：SenMayo遺伝子セットとCytoscapeソフトウェアを使用して、研究者たちは老化遺伝子と代謝物の相互作用ネットワークを構築し、代謝物が老化における役割を理解するための新しいツールを提供しました。

研究の意義本研究は、骨格筋老化のメカニズムに関する我々の理解を豊かにするだけでなく、老化関連疾患に対する治療戦略の開発にも新たな道を示しました。特に、オレイン酸がSASPシグナル制御における潜在的な役割を持つことは、筋肉老化や関連疾患の治療に新たなターゲットを提供する可能性があります。さらに、本研究で採用された非標的メタボローム解析法や遺伝子-代謝物相互作用ネットワーク分析は、他の老化関連研究に参考となる実験設計と技術的アプローチを提供しました。