CRISPR-dCas9によるMSCs中のTSG-6の活性化は、MSC由来の細胞外小胞の内容物を調節し、ヒト椎間板細胞の炎症反応を軽減する

2025-04-20 Sun
CRISPR-dCas9 TSG-6 間葉系幹細胞細胞外小胞椎間板細胞炎症反応ゲノム工学
椎間板変性（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）は、世界中で腰痛の主要な原因の一つであり、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼしています。椎間板変性は通常、炎症反応を伴い、細胞外マトリックス（Extracellular Matrix, ECM）の分解と構造の破壊を引き起こします。細胞療法（例えば、間葉系幹細胞、Mesenchymal Stem Cells, MSCs）が椎間板変性の治療法として探求されていますが、変性した椎間板の微小環境は細胞の生存と移植効果に不利な影響を与えます。近年、間葉系幹細胞が分泌するエクソソーム（Extracellular Vesicles, EVs）は、抗炎症作用と組織修復作用を持つことから注目を集めています。しかし、エクソソームの治療効果はドナーの変動性、異質性、および効力の不足によって制限されています。そのため、遺伝子工学技術を用いてエクソソームの治療効果を強化する方法が研究の焦点となっています。
CRISPR-Cas9遺伝子編集技術は、遺伝子発現を調節するための強力なツールを提供します。「死んだ」Cas9（dCas9）を転写活性化ドメインと結合させることで、研究者はDNA配列を変更することなく特定の遺伝子の発現を活性化することができます。本研究は、CRISPR-dCas9技術を用いて間葉系幹細胞中の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（Tumor Necrosis Factor-Stimulated Gene 6, TSG-6）を活性化し、これらの修飾されたMSCsが分泌するエクソソームのin vitroでのヒト椎間板細胞に対する生物学的活性を評価することを目的としています。
論文の出典本研究は、Rochester Institute of Technology、Georgetown University School of Medicine、University of Rochester Medical Centerなどの研究チームによって行われ、主要な著者にはIker Martinez-Zalbidea、Gabbie Wagner、Karin Wuertz-Kozakなどが含まれます。論文は2025年2月5日に『Cellular and Molecular Bioengineering』誌にオンライン掲載され、タイトルは「CRISPR-dCas9 Activation of TSG-6 in MSCs Modulates the Cargo of MSC-Derived Extracellular Vesicles and Attenuates Inflammatory Responses in Human Intervertebral Disc Cells In Vitro」です。
研究のプロセスと結果1. 間葉系幹細胞の培養とCRISPR活性化研究者は、不死化されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞株（ASC52Telo）を使用し、CRISPR協調活性化メディエーター（Synergistic Activation Mediator, SAM）システムを用いてTSG-6遺伝子を活性化しました。具体的な手順は以下の通りです：
- 細胞培養：ASC52Telo細胞を10%胎牛血清を含む基礎培地で培養し、細胞密度は5000 cells/cm²としました。
- CRISPR活性化：TSG-6のプロモーター領域を標的とする3つの異なる単鎖ガイドRNA（sgRNA）を使用し、レンチウイルスシステムを介してdCas9-VP64およびMS2-p65-HSF1転写活性化複合体を細胞に導入しました。抗生物質によるスクリーニングを経て、TSG-6活性化MSCsと非標的対照群（NTC）を取得しました。
2. エクソソームの抽出と特性評価TSG-6活性化MSCsと非標的対照群からエクソソームを抽出し、以下の手順を実施しました：
- エクソソーム抽出：細胞を48時間培養後、条件培地を回収し、超遠心分離法によりエクソソームを分離しました。
- エクソソーム特性評価：ナノ粒子追跡分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）を用いてエクソソームの粒子径分布を測定し、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscopy, TEM）でエクソソームの形態を観察しました。また、抗体アレイを用いてエクソソームマーカー（CD63、TSG101など）を検出しました。
結果、抽出されたエクソソームは典型的なカップ状の形態を示し、粒子径は主に100-300 nmの範囲に分布し、複数のエクソソームマーカーを発現していることが確認され、高品質のエクソソームが得られたことが示されました。
3. TSG-6活性化がエクソソーム内容物に及ぼす影響定量プロテオミクス解析により、TSG-6活性化MSCsと非標的対照群のエクソソームのタンパク質組成を比較しました。結果、TSG-6活性化エクソソームではTSG-6タンパク質の発現が対照群に比べて顕著に高く（log2 fold change = 5.72）、さらに他の35種類のタンパク質の発現差も確認されました。これにはサイトカイン、成長因子、およびマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤などが含まれます。
4. エクソソームのヒト椎間板細胞に対する抗炎症作用脊柱手術を受けた患者から変性した椎間板細胞を分離し、IL-1βを用いて炎症反応を誘導しました。TSG-6活性化エクソソームと非標的対照群エクソソームをそれぞれIL-1βと共に椎間板細胞に処理し、炎症マーカー（IL-8、COX-2など）の発現への影響を評価しました。
結果、TSG-6活性化エクソソームはIL-8およびCOX-2の発現を有意に抑制し、抗炎症作用を持つことが示されました。しかし、対照群エクソソームと比較して、TSG-6活性化エクソソームの抗炎症効果は顕著に優れているわけではありませんでした。
結論と意義本研究は、CRISPR-dCas9技術を用いて間葉系幹細胞中のTSG-6遺伝子を活性化することに成功し、これらの修飾されたMSCsが分泌するエクソソームが抗炎症効果を持つことを証明しました。TSG-6活性化エクソソームの抗炎症効果は対照群に比べて顕著ではありませんでしたが、この研究は遺伝子工学技術を用いてエクソソームの治療効果を強化するための重要な実験的根拠を提供しました。今後の研究では、複数の遺伝子を同時に活性化するか、エクソソームの生産プロセスを最適化することで、治療効果を向上させることが期待されます。
研究のハイライト革新的な遺伝子工学手法：CRISPR-dCas9技術を間葉系幹細胞エクソソームの遺伝子調節に初めて適用し、エクソソーム治療の新たな研究方向を提供しました。
エクソソームの特性評価と機能検証：複数の実験手法を用いてエクソソームの物理的および生物学的特性を包括的に評価し、その抗炎症作用を検証しました。
臨床応用の可能性：本研究は、椎間板変性などの炎症性疾患の治療における遺伝子工学エクソソーム療法の潜在的可能性を示しました。
その他の有用な情報本研究は、TSG-6活性化がエクソソーム内容物に及ぼす広範な影響をプロテオミクス解析を通じて明らかにし、エクソソームの機能メカニズムを理解するための新たな視点を提供しました。また、研究チームは今後の研究において、エクソソームの免疫調節および組織修復における応用可能性をさらに探求する予定です。
本研究を通じて、遺伝子工学がエクソソーム治療において持つ巨大な可能性を垣間見ることができました。今後の研究が、さらに多くの炎症性および変性疾患の治療にブレークスルーをもたらすことを期待します。