環状RNA-GRIN2Bが神経因性疼痛を抑制するメカニズムの研究

背景紹介

神経因性疼痛は、体性感覚神経系の神経損傷によって引き起こされる持続的な痛みであり、その病因は今日まで完全には解明されておらず、臨床治療は困難を極めています。神経因性疼痛の複雑さを考慮すると、その発症の分子メカニズムを解明し、早期介入戦略と効果的な薬物標的を見つける必要があります。これまでの研究で、ナトリウム依存性カリウムチャネルSlick（標的遺伝子は中程度の伝導性カリウムチャネルに類似した遺伝子配列）が、痛みの感知と炎症反応の調節に重要な役割を果たしていることが分かっています。しかし、環状RNA（circRNA）の神経因性疼痛における具体的な機能はまだ完全には解明されていません。

Slickチャネルに関連する研究では、NF-κBがSlick遺伝子の転写を調節する重要な促進因子であることが示されています。同時に、circRNAは構造の安定性、豊富な発現、組織特異性、発達段階特異性などの特徴から、潜在的な分子診断マーカーや治療標的として注目されています。したがって、本研究の目的は、circGRIN2Bの神経因性疼痛における生物学的機能とその可能性のある分子メカニズムを探ることです。

研究の出典

本論文は、Kun Wang、Zicong Shen、Xin Peng、Xiaotao Wu、Lu Maoらの研究者によって執筆され、中国南京の東南大学医学部、東南大学附属中大病院、南京医科大学生物医学工学・情報学部に所属しています。この論文は2024年の「Neuromolecular Medicine」に掲載されました。

研究プロセス

研究対象は2ヶ月齢、体重230-250グラムの雄性Sprague-Dawleyラットです。Xieの方法（1988）を用いて慢性圧迫損傷（CCI）モデルを確立し、神経因性疼痛をシミュレートしました。実験ラットは無作為に6群（各群6匹）に分けられました：対照+NC群（生理食塩水を陰性対照として）、対照+OE-circGRIN2B群（circGRIN2Bを過剰発現）、対照+sh-circGRIN2B群（circGRIN2Bの発現を抑制）、CCI+NC群、CCI+OE-circGRIN2B群、CCI+sh-circGRIN2B群。腰椎穿刺法によりカテーテルを成功裏に挿入し、その後薬物注射を行いました。circGRIN2Bの生物学的機能を研究するために、本研究では蛍光in situハイブリダイゼーション、全細胞パッチクランプ技術、リアルタイム定量PCR、ウェスタンブロット、免疫蛍光、RNAプルダウン、質量分析、RNA免疫沈降（RIP）、酵素結合免疫吸着測定（ELISA）など、多様な実験を設計しました。

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）

蛍光顕微鏡を用いてラットDRG神経細胞におけるcircGRIN2Bの発現位置を観察した結果、circGRIN2Bで染色された神経細胞において、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）も陽性発現を示しました。

全細胞パッチクランプ技術

それぞれ処理した（野生型とcircGRIN2Bノックアウト群）DRG神経細胞の電気生理学的記録を行った結果、circGRIN2Bのノックアウト後、20mVを増分とする全カリウムイオン電流（I_K）が顕著に減少し、circGRIN2Bのノックアウトが神経興奮性を促進する可能性があることが示されました。

リアルタイム定量PCRとウェスタンブロット

RT-qPCRとウェスタンブロット分析により、circGRIN2Bをノックダウンした場合のみ、Slickチャネルタンパク質と遺伝子発現が顕著に低下することが分かり、circGRIN2BがSlickレベルを調節することでDRG神経細胞の興奮性に影響を与える可能性が示唆されました。

RNAプルダウンと質量分析

ビオチン標識プローブを用いてRNAプルダウン実験を行い、銀染色と質量分析によりcircGRIN2Bと結合するタンパク質がp65であることが示され、circGRIN2BがNF-κBの主要成分であるp65と直接相互作用することが証明されました。

RNA免疫沈降（RIP）とELISA

RIP実験によりcircGRIN2BとP65の結合を検証し、ELISAの結果、CCI+NC群と比較して、CCI+sh-circGRIN2B群の炎症性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）タンパク質レベルが顕著に上昇し、CCI+OE-circGRIN2B群では顕著に低下したことが示され、circGRIN2Bが炎症性サイトカインのレベルを介して神経因性疼痛のプロセスに関与している可能性が示唆されました。

主要な結果

1. DRG神経細胞におけるcircGRIN2Bの発現と、IL-1β刺激下での細胞質から核への移行を確認しました。
2. circGRIN2Bのノックダウンがナトリウム活性化外向きカリウム電流を顕著に減少させ、それにより神経興奮性を増加させることを発見しました。
3. RNAプルダウンとRIP実験により、circGRIN2BがNF-κB p65と直接相互作用し、Slick遺伝子の発現を促進することを証明しました。
4. CCIラットモデル研究により、circGRIN2Bの発現上昇が機械的および熱痛覚過敏を有意に緩和し、同時に炎症因子レベルを低下させることが示されました。
5. NF-κBがDRG組織のSlickプロモーターに結合してその発現を調節することで、circGRIN2BがNF-κBを介してSlickを調節することを間接的に証明しました。

結論

本研究は、circGRIN2BがNF-κB p65と相互作用してSlickの発現を調節し、それにより神経因性疼痛を抑制するメカニズムを明らかにしました。この発見は、circGRIN2B/NF-κB/Slick経路が新しい治療戦略となる可能性を示唆し、その介入が神経因性疼痛の効果的な治療への新たな道を開く可能性があります。

研究の意義

本研究は神経因性疼痛の分子メカニズム研究において大きな進展を遂げ、神経因性疼痛の新しい治療法の潜在的なターゲットを提供しました。DRG神経細胞におけるcircGRIN2Bの作用メカニズムを深く分析することで、将来のcircRNAを用いた神経因性疼痛治療に重要な理論的根拠と実験的基礎を提供しました。

謝辞と貢献

著者は、設計、材料準備、データ収集と分析に関わったすべての人々に感謝の意を表し、本研究が国家自然科学基金（番号：81902252）の支援を受けたことに言及しています。

この論文は、神経因性疼痛におけるcircRNAの役割の理解に重要な学術的価値と臨床的意義を持ち、将来的により特異性が高く、効果的な神経因性疼痛治療法の開発に役立つものです。