在基因组编辑中，sacas9比spcas9具有优越的保真度和不同的编辑结果

2024-08-13 Tue
高保真度和不同基因编辑结果的SaCas9与SpCas9比较研究背景基于Cas9蛋白的CRISPR系统已经成为基因组编辑的强大工具，并在基础研究和临床基因治疗中得到广泛应用。当前，最常用的Cas9变体是来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9和来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9。尽管这两种Cas9蛋白在许多研究中得到了广泛验证，但具体的基因编辑效果比较仍然缺乏系统性研究。因此本文旨在系统比较SpCas9和SaCas9在基因编辑中的效率和精确度，并探讨其在不同剪切长度下的编辑性能。
研究来源本文由来自中国医学科学院血液学研究所等几个研究机构的研究者们撰写，包括Zhi-Xue Yang、Ya-Wen Fu、Jian-Ping Zhang等，研究结果发表在2023年的《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》期刊上。
研究流程研究流程可以分为以下几个步骤：
研究设计和基因组靶向序列选择：
使用ChopChop工具设计靶向人类AAVS1、ALB、B2M1等基因的sgRNA序列
确定Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）和Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）同时识别的PAM序列（NGGRRT）
细胞培养和电转染：
研究包括人类诱导多能干细胞（iPSCs）和K562白血病细胞，两种细胞分别进行标准化培养和电转染
使用Lonza 2b系统进行电转染，将Cas9-sgRNA质粒导入细胞
基因编辑效率评价：
通过一次和二次PCR扩增靶序列，随后进行Illumina深度测序
使用CRISPResso2工具分析编辑频率、HDR效率和dsODN插入率
高通量测序和数据分析：
利用Guide-seq分析评估全基因组特异性检测
对Cas9诱导的双链断裂修复结果进行精确分析，重点研究NHEJ、MMEJ和HDR修复机制
研究结果SpCas9和SaCas9在不同Spacer长度下的编辑效率研究表明：
SpCas9的最优Spacer长度 为20 nt，其中18、19、21 nt的Spacer长度较少数情况下表现出更高的活性（如AAVS1c和B2M1）。
SaCas9更敏感Spacer长度 的变化，最有效的Spacer长度是21-22 nt。当Spacer长度达到23 nt后，编辑效率显著下降。
基因编辑结果和修复类型差异插入缺失频率（Indel）：
在iPSCs和K562细胞中，SaCas9在大多数靶点上表现出更高的Indel频率。
NHEJ修复特性：
SaCas9在NHEJ修复下产生+1插入突变（特别是+T）的频率要比SpCas9低10倍左右，减少了通过Staggered Cut引起的突变。这为DSODN插入和HDR编辑提供了更好的条件。
HDR效率和插入效率：
平均而言，SaCas9在基因插入（例如DSODN）和HDR（例如AAV6-donor）的编辑效率显著高于SpCas9。
脱靶效应通过Guide-seq分析，SaCas9在iPSCs和K562细胞中的总脱靶位点显著少于SpCas9，表明SaCas9在体外基因编辑中具有更高的特异性。使用22-nt spacer的SaCas9编辑显示出更低的脱靶活动。
结论本文的研究结果展示了SaCas9在基因编辑中相较于SpCas9的多方面优越性。特别是在Staggered Cut偏好性、NHEJ修复结果和脱靶效应方面，SaCas9展示了更高的编辑效率和精确度。本文提供的研究为基因编辑，尤其是临床基因治疗中的工具选择和使用提供了重要的理论支持和应用指导。
研究亮点显著更低的脱靶效果：通过Guide-seq进行的高通量测序分析，显示SaCas9系统与SpCas9相比，在基因编辑中的脱靶风险显著降低。
提高编辑效率的方法：本文设计和验证了一种优化的Cas9融合蛋白，通过使用NLS和HMGA2元素，显著提升了基因编辑的效率。
详细的实验设计和分析：本文对Cas9-sgRNA在不同Spacer长度下的敲除效率和修复机制进行了详细的评估，为未来的基因编辑实验设计提供了重要参考。
研究意义本研究系统地比较了SpCas9和SaCas9在基因编辑中的表现，这对于精准基因编辑和基因治疗的发展具有重要意义。SaCas9蛋白高度特异且偏好生成钝尾末端，使其在临床基因治疗中的应用更具优势尤其是在一些对脱靶效应敏感的治疗领域。