全自动微流控芯片在卵内性别鉴定中的应用

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微流控芯片 卵内性别鉴定 重组酶聚合酶扩增 自动化检测 低成本 高灵敏度 动物福利

基于微流控芯片的自动化胚胎性别鉴定技术

学术背景

在蛋鸡养殖业中，孵化后立即处死雄性雏鸡是一种普遍做法，因为雄性雏鸡既不能产蛋，也无法提供优质的肉类。每年，欧盟约有3.72亿只雄性雏鸡在孵化后被处死。这种做法引发了动物福利和伦理问题，促使多个欧洲国家（如德国、法国和意大利）立法禁止这一行为。为了解决这一问题，胚胎性别鉴定（in ovo sexing）成为了最具前景的替代方案。然而，现有的胚胎性别鉴定技术无法同时满足高精度（>98%）、低成本、对胚胎干扰小、适用于所有蛋壳颜色以及每小时处理超过2万枚蛋的要求。

为了解决这些挑战，研究人员开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）的微流控芯片技术，旨在实现自动化、高灵敏度的胚胎性别鉴定。该技术能够在37.7°C的孵化器内，在30分钟内完成对雌性雏鸡特异性基因HINTW的检测，从而为蛋鸡养殖业提供一种高效、低成本的解决方案。

论文来源

这篇论文由Simão Monteiro Belo dos Santos、Celine Wegsteen、Dries Vloemans、Matthias Corion、Bart De Ketelaere、Dragana Spasic和Jeroen Lammertyn共同撰写。作者来自KU Leuven（比利时鲁汶大学）的生物系统系，研究团队在生物传感和微流控技术领域具有丰富的研究经验。该论文于2024年发表在npj Biosensing期刊上，题为《Fully automated sample-to-result simple-RPA microfluidic chip towards in ovo sexing application》。

研究流程与结果

1. 研究目标与背景

研究的主要目标是开发一种能够在孵化器内自动完成胚胎性别鉴定的微流控芯片（simple-RPA芯片）。该芯片基于RPA技术，能够在37.7°C的温度下快速检测雌性雏鸡特异性基因HINTW，从而实现对胚胎性别的早期鉴定（孵化第6至9天）。这一技术不仅能够避免对胚胎的过度干扰，还能满足工业化生产的高通量需求。

2. 实验设计与流程

研究分为以下几个主要步骤：

a) RPA生物检测的离芯片优化

首先，研究团队在离芯片条件下优化了RPA生物检测。通过测试不同引物浓度（0.5、2.5、5和10 µM）和孵育时间（5、10、15和20分钟），确定了最佳的引物浓度（2.5 µM）和孵育时间（15分钟）。实验结果表明，2.5 µM的引物浓度能够提供最高的信噪比（SNR=0.92），而15分钟的孵育时间能够在不影响灵敏度的情况下快速完成检测。

b) 灵敏度测试

在优化了RPA生物检测后，研究团队测试了其灵敏度。通过将合成DNA进行系列稀释（从0.05到1.6 × 10⁻⁵ ng/µL），研究团队发现，使用PCR热循环仪和孵化器作为热源时，RPA检测的灵敏度分别为8 × 10⁻⁵ ng/µL和1.6 × 10⁻⁵ ng/µL。这一结果表明，孵化器作为热源能够提供更高的灵敏度，适合在实际应用中推广。

c) simple-RPA芯片的开发

基于离芯片优化的RPA生物检测，研究团队开发了一种名为simple-RPA的微流控芯片。该芯片采用了一种自驱动的微流控泵技术（SIMPLE技术），能够在单次按压后自动完成液体操作。芯片的设计包括以下几个关键部分： - 样品处理单元：用于精确计量样品（1 µL）并与RPA试剂混合。 - 3D混合室：通过扩展效应实现高效混合。 - 检测单元：集成了横向流动试纸条（LFS），用于比色法检测RPA扩增产物。

d) 芯片性能测试

研究团队在芯片上测试了优化后的RPA生物检测。实验结果表明，simple-RPA芯片能够在30分钟内完成对HINTW合成DNA的检测，检测限（LOD）为8 × 10⁻⁵ ng/µL。这一结果与离芯片实验一致，证明了芯片的可靠性和实用性。

3. 主要结果与结论

研究的主要结果包括： - 成功优化了RPA生物检测，确定了最佳的引物浓度和孵育时间。 - 开发了一种全自动的微流控芯片（simple-RPA芯片），能够在孵化器内完成胚胎性别鉴定。 - 芯片的检测限为8 × 10⁻⁵ ng/µL，能够满足实际应用的需求。

4. 研究的意义与价值

这项研究为蛋鸡养殖业提供了一种高效、低成本的胚胎性别鉴定技术。通过将RPA技术与微流控芯片相结合，研究团队成功实现了自动化、高灵敏度的检测，避免了传统PCR技术的复杂性和高成本。此外，该技术还具有广泛的应用前景，可以用于其他领域，如医学、兽医科学和农业中的病原体检测。

5. 研究亮点

  • 高灵敏度：simple-RPA芯片能够在低至8 × 10⁻⁵ ng/µL的浓度下检测HINTW基因。
  • 全自动化：芯片通过单次按压即可启动，减少了人为操作误差和污染风险。
  • 低成本：芯片的制造成本低于1欧元，适合大规模生产。

总结

这项研究通过开发一种基于RPA技术的微流控芯片，为胚胎性别鉴定提供了一种高效、低成本的解决方案。该技术不仅能够满足蛋鸡养殖业的需求，还具有广泛的应用前景，为其他领域的快速检测提供了新的思路。