ADAM10介导的人类朊病毒蛋白剪切及其与神经退行性疾病的关系

2024-07-30 Tue
ADAM10介导的人类朊病毒蛋白剪切及其与神经退行性疾病的关系背景介绍多功能蛋白质的多肽内切处理在调节其生理功能方面至关重要，同时也在多种病理条件中扮演重要角色。朊病毒蛋白（Prion protein, PrP）作为一种广泛表达的糖磷脂酰基甘露糖糖基锚定糖蛋白，其在神经系统中的高表达性和多种生理任务建议其具有多功能性，但其在致命和传染性神经退行性朊病毒疾病中的关键病理角色也已得到确立，例如Creutzfeldt-Jakob病（CJD）。PrP通过其致病性异构物（Prion protein scrapie, PrPsc）的模板化和进展性错误折叠以及沉积导致神经元死亡和脑泡化。而ADAM10（一种解聚和金属蛋白酶）介导的PrP剪切被认为是一个调节PrP功能和参与神经退行性疾病的机制。鉴于PrP剪切在动物和体外模型中的研究结果，本研究旨在通过生成特异检测人类剪切PrP（shed PrP, sPrP）的抗体，明确ADAM10在剪切过程中的生物学意义及与神经退行性疾病的关系。
研究来源该论文发表于2024年，由Feizhi Song、Valerija Kovac、Behnam Mohammadi及Hermann C. Altmeppen等学者在《Acta Neuropathologica》杂志上发表。他们来自多个世界知名科研机构，包括University Medical Center Hamburg-Eppendorf、University of Ljubljana、University Medical Center of Barcelona等。
研究流程及方法研究对象及样本处理研究采集了多种人类和动物样本，包括后处理人类组织样本（如石蜡包埋组织块和冷冻样本）、脑液样本及细胞系样本。这些样本通过伦理批准并在各机构的实验室中获取和处理。此外，研究还使用了不同种类的转基因小鼠（如Prnp0/0小鼠）进行比较研究，以进一步验证结果的普适性。
抗体生成与特异性验证研究人员首先生成了针对PrP的多克隆抗体sprpy226，用于检测假定在Y226位置剪切的sPrP。通过实验，他们验证了这些抗体的特异性，并通过人类肺癌细胞系a549以及神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y进行初步测试，确认其检测的信号依赖于ADAM10的活性而非ADAM17。
实验程序结构模拟与酶切位点预测：使用Pep-fold3和FlexPepDock工具对人类PrP的C端序列进行建模，并预测ADAM10的潜在酶切位点。
抗体生成与验证：利用兔生成多克隆抗体sprpy226，并通过各种生化实验（包括免疫印迹和ELISA）验证其特异性。
细胞系测试：在转染了人类PrP的SH-SY5Y细胞中，通过使用ADAM10抑制剂以及抗体3F4或6D11来测试剪切sPrP的生成情况。
动物模型验证：使用Prnp0/0小鼠和广泛表达人类PrP的转基因小鼠，进行相关实验以验证在不同生物背景下的研究结果。
主要研究结果酶切位点与ADAM10依赖性：
通过模拟和实验验证，人类PrP的酶切位点被确定在Y226位置，且所生成的sPrP依赖于ADAM10，而非ADAM17。
实验显示，使用ADAM10特异抑制剂（如GI254023X）可以完全阻断sPrP信号，而一般抑制剂（如GW280264X）对ADAM10和ADAM17均有效。
抗体特异性验证：
使用生成的多克隆抗体sprpy226和单克隆抗体v5b2分别检测人类PrP的截短形式（到Y226）和尾部完整形式，通过免疫印迹和ELISA实验验证两者均具有很高的特异性和亲和力。
进一步的免疫共沉淀实验表明sprpy226在检测变性样本时表现良好，而v5b2在天然样本中表现更佳。
PrP结合引发剪切的可行性：
在人类神经系统中，特定抗体结合可以诱导ADAM10介导的PrP剪切，表明在体外条件下可以通过这些抗体来调节PrP的功能。
研究结论本研究通过生成特异性抗体，首次确认了人类PrP在Y226处的生理剪切，并显示这完全依赖于ADAM10。进一步实验显示，这一剪切过程在神经退行性疾病中具有重要的生物学意义，特别是在人类和动物模型中的PrP错误折叠和积聚的病理情况下。通过PrP靶向配体诱导的剪切机制，这一研究为神经退行性疾病的治疗开辟了新的潜在路径。
研究亮点新发现的酶切位点：通过综合结构预测和实验验证，首次揭示了人类PrP在Y226位置的特定酶切位点。
ADAM10依赖性：明确ADAM10在PrP剪切过程中的决定性作用，而非其他金属蛋白酶，为针对ADAM10的治疗策略提供了坚实基础。
特异性抗体工具：生成并验证了高特异性和高亲和力的抗体sprpy226和v5b2，可广泛用于检测和研究人类及相关动物中的sPrP。
意义与应用价值本研究在科学上具有重要意义，为理解朊病毒蛋白在神经退行性疾病中的作用提供了新的见解。同时，通过检测和调控人类PrP的剪切过程，开发新的治疗策略可能成为现实，如通过使用特定抗体来调节PrP的功能，从而对抗相关疾病。
该研究还提供了发展替代诊断生物标志物的潜力，sPrP可能成为一种便于获取的体液生物标志物，帮助早期诊断和监测神经退行性疾病的进展。