SOD1聚集体在家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症患者死后神经组织中的种子活性

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人类超氧化物歧化酶1聚集体在家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症患者死后神经组织中的种子活性检测

背景介绍

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种快速进展的神经退行性疾病，患者在确诊后平均存活2至5年。ALS的主要症状包括肌肉抽搐、肌肉疲劳、抽筋和肌无力，晚期症状包括体重下降、失语和瘫痪，呼吸衰竭是该病的主要致死原因。ALS的病因复杂，约90%的ALS病例为散发性（sporadic ALS, sALS），其余10%为遗传性家族性（familial ALS, fALS）病例。先前的研究表明，ALS患者神经组织中会出现金属蛋白人类超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1, SOD1）的聚集现象，与SOD1基因突变相关的家族性ALS患者尤为显著。此外，在其他形式的ALS中，包括与染色体9开放阅读框72（C9ORF72）基因异常扩增相关的最常见家族性ALS以及散发性ALS，也检测到了SOD1聚集体。

现有的研究表明，SOD1聚集体可能具有朊病毒样的种子传播特性，目前尚需开发新的诊断方法以更深入地理解SOD1在ALS病理中的动力学特征，并评估其作为ALS生物标志物的潜在应用价值。在此背景下，本研究旨在开发一种基于实时振荡诱导转化（real-time quaking-induced conversion, RT-QuIC）技术的种子扩增检测方法，以测量来自ALS患者死后脊髓和大脑运动皮层组织中的SOD1种子活性。

论文来源和作者信息

该研究由Justin K. Mielke、Mikael Klingeborn、Eric P. Schultz、Erin L. Markham、Emily D. Reese、Parvez Alam、Ian R. Mackenzie、Cindy V. Ly、Byron Caughey和Neil R. Cashman等人共同撰写，研究所属机构包括McLaughlin Research Institute、University of Montana、Rocky Mountain Laboratories、University of British Columbia和Washington University。论文发表在2024年《Acta Neuropathologica》第147卷第100页，并于2024年2月1日收到初稿，2024年6月6日进行修订，6月7日正式接受发表。

研究方法

工作流程

该研究的工作流程包括以下几个主要步骤：

  1. 人类SOD1质粒的制备与纯化：研究团队构建并表达了包含全长人类SOD1基因的质粒，经由E. coli菌株BL21（DE3）进行表达和纯化，采用包括金属离子亲和色谱法等纯化技术，确认了表达的SOD1的质量。

  2. 人类死后脊髓和运动皮层组织的制备与处理：研究团队从ALS患者和健康对照组中提取了包括颈椎和胸椎脊髓以及运动皮层在内的组织，制备了不同浓度梯度的组织匀浆。

  3. 免疫捕获实验：使用特定的抗SOD1抗体交联磁珠，通过该抗体捕获聚集的SOD1以控制RT-QuIC检测的特异性。

  4. SOD1 RT-QuIC检测：研究开发了一种新的SOD1 RT-QuIC检测法，使用经优化的反应体系，包括关键反应缓冲液成分（例如SOD1底物、GuHCl、sodium acetate和ThT），在微孔板中进行检测，并使用荧光强度测量聚集反应进程。

  5. 透射电子显微镜分析：为了确认RT-QuIC产生的聚集物为淀粉样纤维，研究团队使用透射电子显微镜观察了聚集物的形态。

  6. 数据分析和统计：通过拟合RT-QuIC曲线计算荧光增强值和滞后期，分析不同ALS病例类型之间的差异。

样本和实验对象

  1. 国家健康研究所（NIH）提供的散发性ALS及疾病对照（thoracic spinal cords and motor cortex）。
  2. 国家大脑银行（Georgetown Brain Bank）提供的家族性ALS脊髓组织样本。
  3. 使用来自UBC的Ian Mackenzie和Cindy Ly团队以及华盛顿大学的其他神经学对照样本。
  4. 从多个实验室获取的数据，经由大量的重复实验和对照实验，保证了数据的可靠性和准确性。

研究结果

SOD1基底物检测特性

通过SOD1的RT-QuIC反应体系，研究发现SOD1聚集体可以诱导荧光强度显著增加，特别是在ALS患者的组织中，而健康对照组中无此现象。表明这些SOD1聚集体具有自我复制和传播特性。

不同ALS类型患者的RT-QuIC检测结果

  1. 家族性ALS（SOD1突变）：RT-QuIC检测到这些患者的脊髓和运动皮层组织中存在大量SOD1聚集体，并表现出较短的滞后期以及高荧光强度。
  2. 家族性ALS（C9ORF72突变）：检测到有相应的SOD1聚集体，显示出类似于SOD1突变患者的传播特性。
  3. 散发性ALS：在散发性ALS患者的组织中也检测到SOD1聚集体，表明wt SOD1在这些患者中亦具有朊病毒样自我传播能力。

不同解剖部位的SOD1种子活性

比较不同解剖部位（如胸椎脊髓和运动皮层）的ALS患者组织，研究显示运动皮层的SOD1种子活性显著高于脊髓，表明ALS病理过程中的神经退行率可能与解剖位置密切相关。

结论和意义

该研究开发并验证了一种基于RT-QuIC的SOD1种子活性检测方法，能够准确检测不同类型ALS患者神经组织中的SOD1聚集体。该方法展示出了作为ALS生物标志物的潜力，尤其在散发性ALS患者中具有重要的诊断和研究意义。通过进一步优化和应用，该检测法可能为ALS的早期诊断和疗效评估提供新的工具。

研究亮点

  1. 新方法开发：研究开发了首个基于RT-QuIC技术的ALS相关SOD1种子活性检测方法，具有较高的灵敏度和特异性。
  2. 多种ALS类型检测：验证了该方法在多种ALS病理类型中的应用，与各种ALS类型的病理机制提供了新的证据。
  3. 解剖特异性差异：发现不同解剖部位的ALS患者组织在SOD1种子活性上的显著差异，为ALS病理扩展机制的研究提供了新视角。

未来展望

基于该研究，下一步将探索该检测方法在活体患者可获得生物样本中的应用潜力，并继续研究不同ALS类型之间的共性和差异，从而更好地理解这一复杂疾病的发病机制，并开发针对性治疗策略。