β-谷甾醇通过抑制tlr4/nf-κb信号通路影响小胶质细胞极化来缓解神经性疼痛

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β-谷甾醇通过抑制 TLR4/NF-κB 信号通路缓解神经性疼痛

背景介绍

神经性疼痛是临床上常见且难以治疗的一类慢性疼痛，其病因复杂且尚未完全明了。研究表明，神经炎症是导致慢性神经性疼痛的主要原因之一。小胶质细胞是中枢神经系统内的常驻免疫细胞，在正常情况下，它们通过分泌神经营养因子参与神经元的发育和维持。然而，在神经微环境稳态遭受外界刺激影响时，小胶质细胞会发生极化，产生两种不同的表型：经典激活的 M1（促炎）表型和交替激活的 M2（抗炎）表型。神经损伤后，小胶质细胞的 M1 极化会导致炎症反应增强、诱发神经痛。因此，通过调控小胶质细胞的极化状态成为缓解神经性疼痛的新策略。

TLR4/NF-κB 信号通路是已知的经典炎症信号通路，激活 TLR4 及其下游的 MyD88、IκB 激酶（IKK）、NF-κB 等分子可以促进促炎因子的表达，从而加剧神经炎症。因此，抑制 TLR4/NF-κB 信号通路的激活可能成为减轻神经炎症的有效方法。

β-谷甾醇是一种植物来源的化合物，它在日常饮食中普遍存在，具有较少的副作用。研究表明，β-谷甾醇不仅可以降低胆固醇，还具有显著的抗炎效果。最近的研究证实，β-谷甾醇通过抑制 TLR4/NF-κB 信号通路减少炎症反应。基于以上背景，本研究探讨了 β-谷甾醇在缓解神经炎症和神经性疼痛方面的潜在作用和机制。

研究来源

本文由 Jinan University 的 Zheng Yachun、Zhao Jiaji、Chang Shiquan 等研究人员联合发布，主要探讨了 β-谷甾醇对小胶质细胞极化及神经性疼痛的调控作用。论文发表于 2023 年的 Journal of Neuroimmune Pharmacology 上。

研究方法

实验设计与流程

本研究采用体内和体外实验相结合的方式探讨了 β-谷甾醇的作用机制。具体实验流程如下：

  1. 体内实验

    • 实验动物及分组：选用 32 只 8 周龄雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠作为研究对象，随机分为四组：假手术组、CCI 模型组、布洛芬组和 β-谷甾醇组，每组 8 只大鼠。
    • 坐骨神经损伤模型构建：采用坐骨神经慢性压迫损伤 (CCI) 方法构建坐骨神经痛模型，包括横切皮肤肌肉后，以 4.0 缝合线在坐骨神经上连续做四条缝合结，每个缝合间距约 1 mm。
    • 药物处理：术后一日开始给予对应药物灌胃，布洛芬组灌胃布洛芬溶液 (10 mg/kg/bid)；β-谷甾醇组灌胃 β-谷甾醇溶液 (50 mg/kg/bid)；假手术组和模型组灌胃生理盐水（0.9%, 6 ml/kg/bid），持续 21 天。
    • 行为学实验：通过 von Frey 测试评估 SD 大鼠的机械痛敏性。

  2. 体外实验

    • 细胞培养及分组：在体外培养 GMI-R1 小胶质细胞并分组。包括对照组、LPS 组、LPS+TAK-242 组、LPS+JSH-23 组、LPS+β-谷甾醇组和 β-谷甾醇组。
    • 细胞活力测定：通过 CCK8 实验测定不同浓度 β-谷甾醇对细胞活力的影响，并筛选适宜浓度进行后续实验。
    • 实时定量 PCR (qRT-PCR)：检测各组细胞中相关基因的 mRNA 表达。
    • 流式细胞术检测：检测小胶质细胞极化标志物 CD32 (M1 标志物) 和 CD206 (M2 标志物)。
    • 免疫荧光检测：通过免疫荧光标记并定量分析小胶质细胞中 M1 标志物和 M2 标志物的表达水平。
    • Western Blot 检测：检测各组细胞中相关蛋白的表达水平。

  3. 数据分析

    • 使用 GraphPad Prism 8.0.2 软件对所有实验数据进行处理和分析，采用单因素方差分析 (ANOVA) 比较组间差异，显著性水平设定为 P < 0.05。

主要结果

  1. 行为学实验结果

    • 结果显示，CCI 组大鼠术后机械痛敏性显著增加，布洛芬组和 β-谷甾醇组的痛敏性逐渐恢复至正常水平。

  2. 血清中炎症因子表达

    • ELISA 结果显示，CCI 组大鼠血清中促炎因子 IL-1β 和 IL-8 水平显著升高，β-谷甾醇治疗 21 天后促炎因子水平显著下降，而抗炎因子 IL-4 水平显著升高。

  3. 坐骨神经 HE 染色

    • HE 染色显示，CCI 组大鼠坐骨神经结构紊乱、神经元丢失、核固缩，并伴随炎症浸润。β-谷甾醇治疗后，神经纤维结构恢复正常，核固缩显著改善。

  4. TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白表达

    • WB 和免疫组化结果显示，CCI 模型激活 TLR4/NF-κB 信号通路，升级促炎因子表达，并促进小胶质细胞激活，而 β-谷甾醇有效抑制这些变化。

  5. 细胞实验结果

    • CCK8 结果确定 β-谷甾醇最佳作用浓度为 40 μM。
    • qRT-PCR 结果显示，β-谷甾醇显著下调 LPS 诱导的促炎因子表达，并上调抗炎因子表达。
    • 流式细胞术和免疫荧光结果表明，β-谷甾醇通过抑制 TLR4/NF-κB 信号通路，减少小胶质细胞 M1 极化比例，并增加 M2 极化比例。

结论

本研究表明，β-谷甾醇可以通过调控小胶质细胞极化、抑制 TLR4/NF-κB 信号通路，减少神经炎症，从而缓解神经性疼痛。这为 β-谷甾醇作为治疗神经性疼痛的新药提供了理论基础和实验依据。

研究亮点

  1. β-谷甾醇显著缓解神经性疼痛：本研究第一次系统地展示了β-谷甾醇在缓解神经性疼痛方面的有效性。
  2. 揭示了潜在机制：通过一系列体内外实验验证了β-谷甾醇通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响小胶质细胞极化。
  3. 安全性分析：HE染色结果显示β-谷甾醇没有明显的肝肾毒性，具有较好的临床应用前景。
  4. 创新性方法：结合体内行为学测试和体外分子生物学技术，全面探讨药物作用机制。