药物治疗通过抑制小鼠模型中的CRMP2磷酸化来减轻视网膜神经节细胞死亡

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科学研究报告：药物治疗通过抑制Collapsin Response Mediator Protein 2磷酸化缓解正常张力性青光眼小鼠模型的视网膜神经节细胞死亡

背景介绍

正常张力性青光眼（Normal Tension Glaucoma, NTG）是青光眼家族中的一种进行性神经退行性疾病。通常情况下，青光眼的发生与眼压（Intraocular Pressure, IOP）水平升高有关，但NTG即使在正常眼压下也会出现视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGC）变性、轴突流失以及视神经受损。NTG作为开角型青光眼的一种亚型，其病理机制引起了广泛关注，尤其是谷氨酸兴奋毒性和氧化应激。在NTG研究中，探索这些致病因素与RGC凋亡之间的关系对于开发有效的治疗方法具有重要意义。

最近的研究显示，抑制Collapsin Response Mediator Protein 2（CRMP2）的磷酸化能够明显减少NTG小鼠模型中的RGC死亡。这项研究旨在评估两种天然化合物Huperzine A（HupA）和Naringenin（Nar）对CRMP2磷酸化的抑制效果，并探索它们是否能够减轻由N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-Aspartate, NMDA）导致的兴奋毒性以及Glast突变小鼠中的RG克死亡。

来源与作者信息

这篇论文由Yuebing Wang、Musukha Mala Brahma、Kazuya Takahashi、Alessandra Nolia Blanco Hernandez、Koki Ichikawa、Syuntaro Minami、Yoshio Goshima、Takayuki Harada和Toshio Ohshima等科学家共同撰写，来自Waseda University, Nara Medical University, Yokohama City University Graduate School of Medicine 和Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science等科研机构。论文于2024年发表在《Neuromolecular Medicine》杂志上。

研究工作流程

研究模型及实验设计

  1. 实验动物: 小鼠实验获得Waseda University动物护理与使用委员会的批准。小鼠在12小时明/暗条件下饲养并提供自由获取食物和水。实验包含野生型和基因修饰的GLAST+/−及CRMP2 KI/KI小鼠。

  2. 眼内注射: 小鼠在10-16周时使用二乙醚麻醉，并在眼内注射20 nmol NMDA以在体内诱导兴奋毒性。对照组注射相同体积的PBS。

  3. 药物处理策略: HupA（0.7 mg/kg）和Nar（200 mg/kg）通过混合食物口服给药。实验组小鼠在眼内注射前一天开始接受HupA和Nar的处理，且不同实验中的处理时间有所不同。

  4. 组织学分析:

    • 免疫组织化学：通过4% PFA灌注固定平展视网膜样本，进行免疫染色分析。
    • H&E染色：小鼠用二乙醚麻醉，取固定后的视网膜样本进行H&E染色，分析RGC损失和内视网膜层（Inner Retinal Layer, IRL）厚度。

  5. 统计分析: 数据以均值±标准误表示。使用Student’s t-test进行两组之间的比较，多组间比较则采用ANOVA和Tukey’s后续检验。分析工具为GraphPad Prism软件。

实验结果及数据分析

  1. 药物处理抑制NMDA诱导的小鼠视网膜CRMP2磷酸化

    • 通过免疫染色观察药物处理组小鼠视网膜中pCRMP2的信号减弱，HupA和Nar显著抑制了由NMDA诱导的CRMP2磷酸化。
    • 定量分析显示，与NMDA处理组相比，经过HupA和Nar处理的小鼠RGC中pCRMP2阳性细胞显著减少。

  2. NMDA诱导模型中RGC变性和IRL变薄减少

    • 经HupA和Nar处理的小鼠表现出视网膜RGC生存率增加及IRL厚度减少的抑制作用。例如，H&E染色结果显示在NMDA处理小鼠中，接受Nar处理的小鼠具有较高的RGC生存率和IRL厚度。

  3. Glast突变小鼠模型中药物处理抑制CRMP2磷酸化

    • 对10周龄的Glast+/−小鼠视网膜进行免疫染色，发现与野生型小鼠相比，Glast+/−小鼠的RGC中CRMP2磷酸化水平显著升高。但在接受HupA和Nar处理后，Glast+/−小鼠的CRMP2磷酸化信号显著减少。

  4. Glast突变小鼠中HupA和Nar抑制RGC退化

    • 通过HupA和Nar处理，Glast+/−的5周龄和10周龄小鼠都展现出RGC丢失的减少和IRL结构的完整性提高。例如，H&E染色分析显示，与对照组相比，药物处理组小鼠的RGC数量显著增加，IRL厚度显著加厚。

  5. Glast突变小鼠中HupA和Nar降低氧化应激

    • 免疫染色显示，未经处理的Glast+/−小鼠中RGC层的4-HNE（氧化应激标志物）表达水平显著升高，而经过HupA和Nar处理后，4-HNE水平显著下降。
    • 这些结果表明HupA和Nar不仅通过抑制CRMP2磷酸化，还通过减少氧化应激在Glast突变小鼠中保护RGC免遭退化。

结论

研究表明，HupA和Nar通过抑制CRMP2磷酸化，显著减少了NMDA注射模型和Glast突变小鼠模型中的RGC死亡和视网膜变性。此外，两种药物还显示出显著减少氧化应激的作用。这些发现为NTG的治疗提供了新的思路，表明HupA和Nar可能成为未来治疗NTG的潜在药物。

研究亮点

  1. 发现药物的多重作用机制：HupA和Nar不仅通过抑制CRMP2磷酸化还通过降低氧化应激来保护RGC。
  2. 多种实验模型验证：研究使用了两个不同的NTG小鼠模型，证明了HupA和Nar在多种情况下均有效。
  3. 提供治疗线索：本研究提供了新的NTG治疗线索，为未来开发有效的神经保护剂提供了基础数据支持。

未来展望

尽管本研究取得了一些积极的结果，药物治疗NTG的具体机制仍需进一步探索。此外，还需要未来的研究来改善HupA和Nar的剂型、有效性、安全性和生物利用度，以期实现临床应用。