Détection multi-cancéreuse par une méthode de PCR digitale en gouttelettes multiplexée pour l’analyse de la méthylation

Contexte

Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde, avec près de 10 millions de décès signalés en 2020. Bien que de nombreux cancers puissent être guéris s’ils sont détectés et traités précocement, de nombreux patients sont encore diagnostiqués à un stade avancé, ce qui entraîne une efficacité thérapeutique réduite. Actuellement, la plupart des pays occidentaux ne proposent des programmes de dépistage que pour le cancer colorectal, le cancer du sein et le cancer du col de l’utérus, tandis que d’autres types de cancer manquent de méthodes de détection précoce efficaces. Par conséquent, le développement d’un outil de diagnostic précoce capable de détecter simultanément plusieurs types de cancer revêt une importance majeure.

La méthylation de l’ADN (DNA methylation) est un biomarqueur qui subit des modifications précoces dans le cancer, offrant une grande stabilité et cohérence. Contrairement aux mutations, les schémas de méthylation présentent des différences significatives entre les cellules cancéreuses et les cellules normales, et ces différences apparaissent tôt dans le processus de cancérogenèse. Ainsi, la détection de la méthylation est considérée comme un outil idéal pour le diagnostic précoce du cancer. Ces dernières années, la technologie de PCR digitale en gouttelettes (droplet digital PCR, ddPCR) a été largement utilisée pour la détection de la méthylation en raison de sa haute sensibilité et de sa capacité de quantification absolue. Cependant, aucune étude n’avait jusqu’à présent utilisé la technologie ddPCR multiplexée pour la détection multi-cancéreuse.

Source de l’article

Cet article a été réalisé par une équipe de recherche de l’Université d’Anvers et de l’hôpital universitaire d’Anvers en Belgique, avec comme principaux auteurs Isabelle Neefs, Nele De Meulenaere, Thomas Vanpoucke, entre autres. L’article a été publié en ligne le 6 septembre 2024 dans la revue Molecular Oncology, avec le DOI 10.¹⁰⁰²⁄₁₈₇₈-0261.13708.

Processus et résultats de la recherche

1. Sélection des cibles et conception expérimentale

L’équipe de recherche a sélectionné 1792 sites CpG différentiellement méthylés à partir des données de l’Atlas du génome du cancer (The Cancer Genome Atlas, TCGA), puis en a choisi 40 présentant des différences significatives pour une analyse plus approfondie. Finalement, l’équipe a identifié trois cibles de méthylation (target 1, target 2 et target 3) et a développé deux méthodes de détection par ddPCR : une méthode triple (triplex assay) pour détecter simultanément target 1 et target 2, et une méthode double (duplex assay) pour détecter target 3.

2. Collecte et traitement des échantillons

L’équipe de recherche a collecté 103 échantillons de tumeurs et 109 échantillons de tissus normaux adjacents, couvrant huit types de cancer courants : cancer du poumon, cancer du sein, cancer colorectal, cancer de la prostate, cancer du pancréas, cancer de la tête et du cou, cancer du foie et cancer de l’œsophage. Tous les échantillons ont été examinés au microscope par un pathologiste pour confirmer le type de tissu et le pourcentage de cellules tumorales (tumor cell percentage, TCP). Après extraction de l’ADN, les échantillons ont été traités par conversion au bisulfite pour distinguer l’ADN méthylé de l’ADN non méthylé.

3. Optimisation des méthodes de détection par ddPCR

L’équipe de recherche a optimisé les méthodes de détection par ddPCR en utilisant des gradients de température et de concentration de sondes. La température optimale pour la méthode triple était de 55°C, avec des concentrations de sondes de 450 nM (target 1), 680 nM (target 2 - FAM) et 1,4 µM (target 2 - SUN). La méthode double a été optimisée à 58°C avec une concentration de sonde de 2,93 µM. Les méthodes de détection optimisées ont montré une excellente reproductibilité et sensibilité dans les contrôles positifs et négatifs.

4. Analyse de la méthylation

L’équipe de recherche a utilisé les méthodes de détection par ddPCR optimisées pour analyser la méthylation dans 103 échantillons de tumeurs et 109 échantillons de tissus normaux adjacents. Les résultats ont montré que tous les types de cancer (à l’exception du cancer colorectal) présentaient des différences significatives de méthylation pour target 1. Les targets 2 et 3 ont également montré des différences significatives de méthylation pour tous les types de cancer. En particulier, les différences de méthylation étaient les plus marquées pour le cancer du poumon et le cancer du pancréas.

5. Analyse de la sensibilité et de la spécificité

En utilisant l’analyse des courbes ROC (receiver-operator characteristic), l’équipe de recherche a évalué la sensibilité et la spécificité de chaque cible. Les résultats ont montré que la sensibilité de target 1 seule était de 82,5 %, avec une spécificité de 98,2 %, tandis que target 2 seule avait une sensibilité de 76,6 % et une spécificité de 93,6 %. Cependant, en combinant target 1 et target 2, la sensibilité augmentait à 93,2 %, avec une spécificité de 92,7 %. En ajoutant target 3, la sensibilité globale atteignait 94,1 %, avec une spécificité de 87,3 %.

Conclusion et signification

Cette étude est la première à rapporter une méthode de détection multi-cancéreuse basée sur la technologie ddPCR multiplexée pour l’analyse de la méthylation. En combinant trois cibles de méthylation, cette méthode permet une détection hautement sensible et spécifique pour huit types de cancer, avec une aire sous la courbe (AUC) globale de 0,948. Ces résultats jettent les bases pour le développement futur d’outils de diagnostic précoce multi-cancéreux basés sur la biopsie liquide.

Points forts de la recherche

1. Détection multi-cancéreuse : Cette étude est la première à utiliser la technologie ddPCR multiplexée pour détecter la méthylation dans huit types de cancer, offrant un large potentiel d’application.
2. Haute sensibilité et spécificité : La combinaison de plusieurs cibles de méthylation a significativement amélioré la sensibilité et la spécificité de la détection, en particulier pour le cancer du poumon et le cancer du pancréas.
3. Optimisation des méthodes de détection : L’équipe de recherche a optimisé les méthodes de détection par ddPCR en utilisant des gradients de température et de concentration de sondes, fournissant une référence pour le développement de méthodes de détection multiplexées plus efficaces à l’avenir.

Perspectives futures

L’équipe de recherche prévoit d’évaluer davantage l’efficacité de cette méthode dans les échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) et dans les biopsies liquides, afin de valider son application pratique dans le diagnostic clinique. De plus, avec l’introduction du système QX600 de Bio-Rad, il sera possible à l’avenir de détecter davantage de cibles en multiplex, améliorant ainsi la sensibilité et la spécificité de la détection.

Remerciements

L’équipe de recherche remercie tous les patients et la biobanque de l’hôpital universitaire d’Anvers pour leur contribution, ainsi que la technicienne de laboratoire Anne Schepers pour son travail dans le traitement des échantillons. Cette recherche a été soutenue par l’Université d’Anvers et le Fonds de la Recherche Scientifique (FWO) en Belgique.

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Cette étude fournit un nouvel outil et une nouvelle méthode pour le diagnostic précoce du cancer, offrant une valeur scientifique et clinique significative. À l’avenir, avec le développement continu de la technologie, cette méthode de détection multi-cancéreuse pourrait être largement appliquée dans la pratique clinique, aidant ainsi davantage de patients à bénéficier d’un diagnostic et d’un traitement précoces.