Identification des mutants de polycystine 2 ciblés pour la dégradation associée au réticulum endoplasmique

Contexte académique

La polykystose rénale autosomique dominante (PKDAD) est une maladie génétique courante qui conduit finalement à l’insuffisance rénale terminale. La PKDAD est principalement causée par des mutations dans les gènes PKD1 et PKD2, qui codent respectivement pour la polycystine 1 (PC1) et la polycystine 2 (PC2). PC2 est un canal cationique non sélectif, et les mutations liées à la maladie perturbent ses fonctions normales, y compris la signalisation et la sécrétion de liquides. Bien que PC1 et PC2 soient connus comme facteurs responsables de la PKDAD depuis environ 30 ans, le mécanisme exact par lequel la plupart des mutations faux-sens de PC2 provoquent la PKDAD reste incertain. En particulier, il n’a pas été suffisamment étudié si les mutations faux-sens de PC2 affectent son repliement, entraînant ainsi sa dégradation via la voie de dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD).

Cette étude vise à examiner si les mutations faux-sens de PC2 liées à la maladie affectent son repliement et conduisent à sa dégradation via la voie ERAD. À cette fin, les chercheurs ont développé un nouveau système d’expression de PC2 chez la levure et ont utilisé ce système pour étudier le processus de biosynthèse de PC2. Ils ont également étudié la stabilité, le niveau d’ubiquitination et la localisation à la surface cellulaire de deux mutants de PC2 liés à la maladie (D511V et R322Q) dans la levure et les cellules HEK293, et ont exploré si le repliement de ces mutants pouvait être corrigé dans des conditions de basse température.

Source de l’article

Cet article a été co-rédigé par Christopher J. Guerriero, Marcelo D. Carattino, Katherine G. Sharp, Luke J. Kantz, Nikolay P. Gresko, Michael J. Caplan et Jeffrey L. Brodsky. Les auteurs sont issus du département de biologie de l’Université de Pittsburgh, du département de médecine et de biologie cellulaire de l’Université de Pittsburgh, et du département de physiologie cellulaire et moléculaire de l’Université de Yale. L’article a été publié pour la première fois dans le journal American Journal of Physiology-Cell Physiology le 23 décembre 2024, avec le DOI 10.1152/ajpcell.00776.2024.

Processus de recherche et résultats

1. Développement d’un système d’expression de PC2 chez la levure

Les chercheurs ont d’abord développé un nouveau système d’expression de PC2 chez la levure pour étudier le processus de biosynthèse de PC2. Ils ont exprimé la version humaine de PC2 avec une triple étiquette HA en N-terminal dans la levure et ont construit des vecteurs d’expression à faible copie (CEN) et à haute copie (2μ). En comparant l’impact des différents vecteurs sur la croissance de la levure, ils ont découvert que les vecteurs à haute copie ralentissaient la croissance de la levure, donc les expériences ultérieures ont principalement utilisé les vecteurs à faible copie.

Pour valider l’expression et la localisation de PC2 dans la levure, les chercheurs ont analysé la glycosylation de PC2. Les résultats ont montré que PC2 était glycosylé à la fois dans la levure et les cellules HEK293, et que le traitement par l’endoglycosidase H (Endo H) éliminait les formes glycosylées de PC2, indiquant que PC2 se localise correctement dans le réticulum endoplasmique (RE) et s’insère dans la membrane du RE. Des observations supplémentaires par microscopie en cellules vivantes ont également confirmé que la protéine de fusion PC2-GFP se localise principalement dans le RE dans la levure et les cellules HEK293.

2. Stabilité des mutants de PC2 et ciblage par ERAD

Les chercheurs ont d’abord comparé les niveaux d’expression à l’état stable de PC2 sauvage et de deux mutants liés à la maladie (D511V et R322Q) dans la levure. Les résultats ont montré que les niveaux d’expression du mutant D511V étaient significativement réduits, tandis que ceux du mutant R322Q étaient similaires à ceux de PC2 sauvage. Des expériences de poursuite avec la cycloheximide (Cycloheximide Chase) ont montré que le mutant D511V était instable dans la levure, alors que la stabilité du mutant R322Q était similaire à celle de PC2 sauvage.

Pour examiner si le mutant D511V était dégradé via la voie ERAD, les chercheurs ont traité les cellules avec un inhibiteur du protéasome, le MG132. Les résultats ont montré que le traitement par MG132 stabilisait significativement le mutant D511V, indiquant qu’il est effectivement dégradé via la voie ERAD. Des expériences supplémentaires d’ubiquitination ont montré que les niveaux d’ubiquitination du mutant D511V dans la levure étaient significativement plus élevés que ceux de PC2 sauvage et du mutant R322Q.

3. Test de l’activité fonctionnelle de PC2 dans la levure

Pour tester si PC2 forme un canal fonctionnel dans la levure, les chercheurs ont utilisé un test quantitatif basé sur la croissance de la levure. Ils ont utilisé une souche de levure dépourvue de transporteurs de potassium endogènes (Trk1 et Trk2) et ont testé la fonction de PC2 dans un milieu pauvre en potassium. Les résultats ont montré que PC2 sauvage ne pouvait pas soutenir la croissance de la levure dans un milieu pauvre en potassium, tandis qu’un mutant fonctionnellement amélioré de PC2 (PC2_2a) pouvait soutenir la croissance. Cependant, les mutants D511V et R322Q dans le contexte de PC2_2a ne pouvaient pas soutenir la croissance, indiquant que ces mutants avaient perdu leur fonction de canal.

4. Étude des mutants de PC2 dans les cellules HEK293

Pour vérifier si les résultats obtenus dans la levure étaient applicables aux cellules eucaryotes supérieures, les chercheurs ont exprimé PC2-GFP et ses mutants dans des cellules HEK293. Les résultats ont montré que les niveaux d’expression à l’état stable des mutants D511V et R322Q étaient significativement réduits dans les cellules HEK293. Des expériences supplémentaires de poursuite avec la cycloheximide ont montré que ces deux mutants étaient instables dans les cellules HEK293, et leurs niveaux d’ubiquitination étaient significativement plus élevés que ceux de PC2 sauvage.

Les chercheurs ont également testé la localisation des mutants de PC2 à la surface des cellules HEK293 par biotinylation de surface cellulaire. Les résultats ont montré que la localisation à la surface cellulaire des mutants D511V et R322Q était significativement réduite, indiquant que les défauts de repliement de ces mutants affectaient leur transport vers la surface cellulaire. Cependant, dans des conditions de basse température (26°C), les niveaux totaux d’expression et la localisation à la surface cellulaire de ces deux mutants ont été partiellement restaurés, suggérant que leurs défauts de repliement peuvent être corrigés par une température basse.

5. Test de la fonction de PC2 dans les ovocytes de xénope

Pour étudier davantage la fonction des mutants de PC2, les chercheurs ont exprimé un mutant fonctionnellement amélioré de PC2 (F604P) et ses mutants liés à la maladie (D511V et R322Q) dans des ovocytes de xénope, et ont mesuré leurs courants par clampage de tension à deux électrodes (TEVC). Les résultats ont montré que le mutant D511V avait complètement perdu sa fonction de canal dans les ovocytes, tandis que le courant du mutant R322Q était significativement inférieur à celui du mutant F604P, mais supérieur à celui du groupe contrôle non injecté. Ce résultat suggère que le défaut de repliement du mutant R322Q peut être partiellement corrigé à basse température, restaurant ainsi partiellement la fonction du canal.

Conclusions et signification

Cette étude montre que certaines mutations faux-sens de PC2 entraînent des défauts de repliement des protéines et sont dégradées via la voie ERAD. Les chercheurs ont développé un nouveau système d’expression de PC2 chez la levure pour étudier la biosynthèse et la fonction de PC2, et ont découvert que le mutant D511V est dégradé via la voie ERAD dans la levure et les cellules HEK293. De plus, le mutant R322Q présente également des caractéristiques de ciblage par ERAD dans les cellules HEK293, mais est relativement stable dans la levure. Dans des conditions de basse température, le repliement et la localisation à la surface cellulaire de ces deux mutants ont été partiellement restaurés, suggérant que leurs défauts de repliement peuvent être corrigés par une intervention médicamenteuse.

Le point fort de cette étude réside dans le développement d’un nouveau système modèle de levure permettant de dépister rapidement et identifier les mutants de perte de fonction de PC2, et de révéler le mécanisme par lequel certaines mutations faux-sens de PC2 sont dégradées via la voie ERAD. De plus, l’étude montre que la basse température peut partiellement corriger les défauts de repliement des mutants de PC2, offrant ainsi de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques contre la PKDAD.

Valeur de la recherche

Cette étude révèle non seulement le mécanisme par lequel les mutations faux-sens de PC2 sont dégradées via la voie ERAD, mais elle offre également de nouvelles stratégies potentielles pour le traitement de la PKDAD. En développant un système modèle de levure, les chercheurs peuvent rapidement dépister et identifier les mutants de perte de fonction de PC2 et fournir une plateforme expérimentale importante pour le développement futur de médicaments. De plus, l’étude montre que la basse température peut partiellement corriger les défauts de repliement des mutants de PC2, fournissant ainsi une base théorique pour le développement d’agents correcteurs de repliement de protéines ciblant la PKDAD.

Cette étude fournit de nouvelles perspectives pour comprendre le mécanisme pathogène des mutations faux-sens de PC2 et ouvre de nouvelles directions pour le développement de stratégies thérapeutiques contre la PKDAD.