Analyse systématique du rôle de NDUFAF6 dans l’assemblage de Complex I et les maladies mitochondriales

Introduction

Le complexe I mitochondrial (complex I, CI) est une composante cruciale de la chaîne respiratoire. Il joue un rôle dans la phosphorylation oxydative (oxphos) en introduisant des électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale et en générant et maintenant le potentiel électrochimique qui alimente la synthèse d’ATP avec les complexes II à IV. Des études montrent que les défauts isolés du CI constituent l’une des causes les plus courantes des principales maladies mitochondriales, affectant environ une personne sur 5000. Environ la moitié des défauts du CI sont attribués à des variantes pathogènes affectant les facteurs d’assemblage du CI (CI assembly factors, CIAFs), qui ne font pas partie de l’enzyme complète CI. Bien que ces CIAFs jouent un rôle significatif dans la pathogenèse des maladies du CI, leurs fonctions moléculaires exactes ne sont pas encore claires, ce qui complique non seulement l’étude de leur mécanisme, mais aussi l’interprétation et le diagnostic des variants génétiques potentiellement pathogènes.

Source

Cette étude est publiée dans la revue « Nature Metabolism », avec le titre « Systematic analysis of NDUFAF6 in Complex I Assembly and Mitochondrial Disease », doi : https://doi.org/10.1038/s42255-024-01039-2. Les auteurs de cet article incluent Andrew Y. Sung, Rachel M. Guerra, Laura H. Steenberge, entre autres. Ils proviennent de plusieurs institutions de recherche renommées, telles que la Faculté de Médecine de l’Université du Wisconsin aux États-Unis, la Faculté de Médecine de l’Université de Washington à Saint-Louis, Chelsea, et la Faculté de Sciences Médicales de l’Université de Newcastle au Royaume-Uni; et l’Institut de Génétique Humaine de l’Université Technique de Munich en Allemagne. Les recherches ont débuté le 6 septembre 2023 et ont été acceptées pour publication le 28 mars 2024.

Méthodologie et processus de recherche

Workflow du scan mutationnel en profondeur

L’équipe de recherche a conçu une méthode de scan mutationnel en profondeur (DMS) pour évaluer systématiquement les fonctions de milliers de variantes du gène NDUFAF6. Voici les étapes expérimentales employées :

1. Création de lignées cellulaires HEK293T knock-out NDUFAF6 : Les chercheurs ont d’abord utilisé la technique CRISPR-Cas9 pour créer deux lignées cellulaires af6 knock-out (KO) indépendantes, puis ont validé ces lignées en utilisant le séquençage Sanger, le western blot et les tests d’activité du CI dans un gel.

2. Génération et transfection de la banque de mutants : Les chercheurs ont synthétisé une banque de mutants couvrant toutes les mutations possibles de NDUFAF6, clonées dans un vecteur viral lent, puis transfectées dans les cellules KO af6.

3. Sélection et sélection des variants fonctionnels : Les cellules KO contenant les variants mutants de NDUFAF6 ont été sélectionnées dans un milieu avec du galactose comme seule source de carbone, pour sélectionner les variants fonctionnels capables de croître dans ce milieu.

4. Analyse de séquençage en profondeur : Grâce à la technologie de séquençage haut débit, ils ont analysé le rapport de lecture de chaque variant avant et après sélection dans le milieu galactose, calculant les scores d’adaptabilité des variants.

Les résultats de leur scan mutationnel ont été validés par diverses méthodes, y compris la profondeur de séquençage élevée, des scores d’adaptabilité hautement corrélés et la bonne correspondance entre la sensibilité des mutants simulés et les modèles structurels attendus.

Analyse des interactions protéine-protéine

En combinant les données du scan mutationnel en profondeur et les prédictions de modèles af6 d’AlphaFold, une série d’expériences ont été conduites pour explorer les fonctions moléculaires d’af6. Des techniques de spectrométrie de masse en pontage ont permis d’identifier les partenaires de liaison potentiels d’af6, indiquant une association spécifique avec la sous-unité NDUFS8 du CI. En utilisant la double hybride de levure, les mutations de surface d’af6 ont été testées pour leur impact sur l’interaction avec NDUFS8, démontrant que des sites de surface spécifiques régulent cette interaction.

Expériences de Blue Native Electrophoresis et Western Blot

Pour déterminer le rôle médiateur d’af6 dans l’assemblage du CI, les chercheurs ont suivi le mode de migration des sous-unités du module Q et des facteurs d’assemblage dans les lignées cellulaires HAP1 sauvages et knock-out CIAF, prouvant qu’af6 facilite l’assemblage de NDUFS8 dans le produit intermédiaire de 125 kDa.

Principaux résultats

Identification de la fonction af6 et intégration de NDUFS8

Les données du scan mutationnel en profondeur, couplées aux prédictions structurelles, ont révélé qu’af6 est une pseudo-enzyme qui se lie directement à la sous-unité NDUFS8 du CI et guide son intégration dans l’intermédiaire d’assemblage de 125 kDa. Les expériences ultérieures ont montré qu’une surexpression de NDUFS8 pouvait compenser les défauts causés par l’absence d’af6, offrant un potentiel thérapeutique pour cette interaction spécifique.

Régions fonctionnelles sensibles aux mutations

Les données du scan mutationnel ont également mis en évidence des régions protéiques particulièrement sensibles aux mutations, suggérant une importance fonctionnelle. Par exemple, la structure hélicoïdale C-terminale de l’af6 joue un rôle crucial dans son association à la membrane, et cette association est essentielle pour l’assemblage du CI.

Identification de nouveaux variants pathogènes

Cette étude a soutenu expérimentalement la pathogénicité de sept nouvelles variantes af6 associées à la pathologie humaine et a fourni des preuves fonctionnelles pour plus de 5000 variantes af6 non annotées, créant une base de ressources cliniques pour soutenir le diagnostic des maladies liées à af6.

Conclusions et implications

Les nouvelles découvertes de cette étude comblent les lacunes concernant le rôle moléculaire d’af6 dans l’assemblage du CI et offrent de nouvelles ressources de diagnostic pour les variants fonctionnels et la causalité des maladies. En outre, l’étude propose une voie thérapeutique potentielle en régulant les niveaux de NDUFS8 pour compenser directement les dysfonctionnements d’af6. Les données de scans mutationnels en profondeur ont également amélioré le cadre de classification des variants de l’ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics), raffinant la classification de plusieurs variants existants et identifiant sept nouveaux variants pathogènes.

Points forts de l’étude

1. Identification d’af6 en tant que pseudo-enzyme : Cette étude confirme qu’af6 médiat l’assemblage du CI via des interactions protéine-protéine plutôt que l’activité enzymatique.
2. Application de nouvelles méthodes et technologies : La méthode systématique du scan mutationnel en profondeur fournit un nouvel outil pour l’étude des protéines mitochondriales à fonctions indéfinies.
3. Valeur clinique : Des données étendues de variantes fonctionnelles soutiennent des diagnostics plus précis des maladies liées à af6 et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Cette étude démontre avec succès l’importance de la compréhension approfondie des facteurs d’assemblage des protéines mitochondriales et offre un cadre expérimental précieux et des méthodologies pour l’étude d’autres protéines mitochondriales aux fonctions encore inconnues.