L’expression de CCL2 induite par TLR7 via NF-κB dans les neurones

Contexte de recherche

Les récepteurs de type Toll (Toll-like receptors, TLRs) sont l’un des mécanismes importants pour reconnaître les structures moléculaires spécifiques des microbes. Chez l’homme, dix TLRs sont connus (TLR1-10), parmi lesquels TLR3 et TLR7 sont situés sur la membrane endosomale et jouent un rôle important dans la détection des acides nucléiques dérivés des virus et l’induction de réponses immunitaires antivirales (Nishiya et al., 2005). TLR3 reconnaît l’ARN double brin (dsRNA), tandis que TLR7 peut se lier à l’ARN simple brin (ssRNA) et aux dérivés d’imidazoquinoline (Alexopoulou et al., 2001; Diebold et al., 2004; Hemmi, 2002). Actuellement, la réponse immunitaire de TLR7 dans le système nerveux central (SNC) n’est pas entièrement claire, mais des études récentes suggèrent que TLR7 joue un rôle clé dans l’immunité innée contre les virus neurotropes tels que le virus du Nil occidental (WNV) et le virus Langat (Town et al., 2009; Baker et al., 2013). Les principaux types cellulaires du système nerveux central, tels que les astrocytes, les cellules microgliales et les neurones, expriment tous TLR7 (Gern et al., 2021). L’activation de la voie de signalisation TLR7 dans les astrocytes et les cellules microgliales est cruciale pour la réponse immunitaire contre les virus neurotropes (Luo et al., 2019; Mukherjee et al., 2019). De plus, l’agoniste de TLR7/8 Resiquimod (un composé imidazoquinoline) active les cellules microgliales pour produire des chimiokines pro-inflammatoires, y compris le ligand 2 du motif C-C (CCL2) (Kwon et al., 2022). Comme les cellules gliales, les neurones expriment également TLR7 (Gern, 2021; Lehmann et al., 2012), ce qui suggère qu’ils peuvent activer le système immunitaire en réponse aux ligands de TLR7. Cependant, la signification de l’expression de TLR7 dans les neurones n’est pas claire. Par conséquent, cette étude visait à déterminer si le Resiquimod pourrait induire l’expression de chimiokines inflammatoires dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y.

Source de l’étude

Cet article intitulé “Le Resiquimod induit l’expression de CCL2 via NF-κB dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y” a été rédigé par Masatoshi Kaizuka, Shogo Kawaguchi, Tetsuya Tatsuta, Mayuki Tachizaki, Yuri Kobori, Yusuke Tanaka, Kazuhiko Seya, Tomoh Matsumiya et Tadaatsu Imaizumi, appartenant respectivement aux départements de Gastroentérologie et Hématologie, à l’Institut de recherche en neurosciences, au département de Biologie vasculaire, au département de Médecine respiratoire et au département des Sciences de la santé de la Hirosaki University Graduate School of Medicine. L’article a été publié en 2024 dans le volume 26, numéro 16 de la revue “Neuromolecular Medicine”. L’auteur correspondant est Shogo Kawaguchi, dont l’adresse e-mail est kawaguchi.s@hirosaki-u.ac.jp.

Contenu et processus de recherche

Cette étude a révélé progressivement le mécanisme d’induction de CCL2 par le Resiquimod dans les cellules SH-SY5Y à travers une conception expérimentale détaillée et une analyse des données.

Processus expérimental

1. Culture cellulaire : La lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y a été cultivée dans un milieu DMEM/F12 contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 mg/ml de pénicilline-streptomycine. Pour obtenir des cellules SH-SY5Y différenciées, les cellules ont été cultivées pendant 6 jours dans un milieu supplémenté avec 10 µM d’acide rétinoïque tout-trans, en changeant le milieu tous les 2 jours.

2. Microscopie à immunofluorescence (IF) : L’expression de TLR7 dans les cellules SH-SY5Y a été déterminée par microscopie IF. Après fixation des cellules, elles ont été immunomarquées avec des anticorps spécifiques, et la localisation et l’expression de TLR7, TLR3 et du facteur nucléaire-κB (NF-κB) p65 ont été observées au microscope optique.

3. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel avec transcription inverse (qRT-PCR) : L’ARN total a été extrait des cellules, l’ADNc monocaténaire a été synthétisé, et une analyse qRT-PCR a été réalisée avec des amorces spécifiques pour évaluer les niveaux d’ARNm de CCL2, CXCL8 et CXCL10.

4. Western Blotting : L’expression de IκB-α, p-p65, p65 et Actine dans les lysats cellulaires a été détectée par Western blot pour évaluer l’activation de la voie de signalisation NF-κB.

5. Test d’immunoabsorption enzymatique (ELISA) : Les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et les niveaux protéiques de CCL2, CXCL8 et CXCL10 ont été mesurés à l’aide de kits ELISA.

6. Interférence ARN (ARNi) : Les cellules SH-SY5Y ont été transfectées avec un siRNA p65 ou un siRNA contrôle négatif dans un tampon avec un réactif lipidique, et l’effet du knockdown de p65 sur l’expression de CCL2 induite par le Resiquimod a été examiné.

Résultats de recherche

1. Expression de base : Les résultats de microscopie IF ont montré que TLR7 et TLR3 sont exprimés de manière constitutive dans les cellules SH-SY5Y et sont localisés près du noyau cellulaire. Après stimulation par le Resiquimod et le Poly IC, les niveaux d’ARNm de CCL2, CXCL8 et CXCL10 ont été rapidement régulés à la hausse.

2. Régulation positive de l’expression génique : L’induction de CCL2, CXCL8 et CXCL10 par le Resiquimod était dépendante de la concentration, et les résultats des tests ELISA ont montré que le Resiquimod augmentait significativement la sécrétion de CCL2, tandis que les changements de CXCL8 et CXCL10 étaient moindres.

3. Dépendance à NF-κB : Les résultats du Western blot ont montré que le Resiquimod augmentait significativement l’expression de p-p65 et entraînait la translocation nucléaire de p65. Les expériences d’ARNi ont en outre démontré que le knockdown de p65 réduisait significativement l’expression et la sécrétion de CCL2 induites par le Resiquimod.

Conclusions de l’étude

Cette étude révèle pour la première fois que le Resiquimod induit significativement l’expression de CCL2 dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y en activant la voie NF-κB. CCL2 joue un rôle clé dans la réponse immunitaire du système nerveux central via son récepteur CCR2. Les résultats suggèrent que le Resiquimod a le potentiel d’être appliqué comme agent thérapeutique potentiel dans les infections virales du système nerveux central grâce à son effet immunostimulant.

Points forts de la recherche

Les principaux points forts de cette étude comprennent : 1. Vérification de l’expression de base de TLR7 et de l’effet stimulant du Resiquimod dans les cellules SH-SY5Y. 2. Révélation détaillée du mécanisme moléculaire par lequel le Resiquimod induit CCL2 en activant la voie NF-κB. 3. Les données expérimentales soutiennent la valeur du Resiquimod en tant qu’agent immunothérapeutique potentiel dans les infections virales du système nerveux central.

Valeur de la recherche

Cette étude offre une nouvelle perspective pour comprendre la fonction de TLR7 dans les neurones et jette les bases du développement d’immunothérapies contre les infections virales neurologiques. En même temps, l’étude souligne également les directions futures pour la recherche sur les interactions de stimulation TLR7 entre les neurones et les cellules gliales, soulignant l’importance d’explorer pleinement les réponses des lignées cellulaires neuronales non primaires.

Cette recherche fournit un soutien théorique important et une base expérimentale pour des recherches ultérieures dans les domaines des neurosciences et de l’immunologie.