Grepore-seq：長範囲PCRとナノポアシーケンシングを用いた遺伝子編集後の変化を検出する堅牢なワークフロー

研究背景

CRISPR/Cas9システムは、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼシステムとして、ゲノム編集で広く応用されています。臨床治療での潜在的な可能性が高まるにつれ、遺伝子編集結果の包括的な評価がますます重要になっています。しかし、大規模で経済的かつパイプライン化された方法で遺伝子編集の結果を検出する方法、特に大きな断片の挿入や欠失を検出する方法が不足しています。研究によると、CRISPR/Cas9編集後に非標的効果が発生する可能性があり、大規模な欠失や複雑なゲノム再編成などが臨床応用に課題をもたらしています。

研究目的と革新性

上記の問題を解決するため、本研究では「grepore-seq」という新しい処理ワークフローを導入しました。これは長範囲PCRとナノポアシーケンシングを組み合わせ、CRISPR/Cas9編集後の様々な遺伝子変化を効率的かつ正確に検出します。Oxford Nanoporeシーケンシングの比較的高いエラー率に対処するため、研究者らはナノポアアンプリコンのリード配列をgreppingすることでバーコード付き配列を捕捉する新しいパイプラインを開発しました。このワークフローはGrepseqと名付けられ、CRISPR/Cas9編集後の様々な遺伝子変化（NHEJが仲介するdsODN挿入やHDRが仲介する大規模な挿入など）を評価でき、Illuminaの次世代シーケンシング結果と良好な一致を示しました。

研究の出典

本論文の研究は、Zi-Jun Quan、Si-Ang Li、Zhi-Xue Yang、Juan-Juan Zhaoらによって共同で行われ、主に中国医学科学院血液病病院の研究チームによるものです。論文は2023年に「Genomics Proteomics Bioinformatics」誌に掲載されました。

研究プロセス

研究対象とサンプル処理

研究ではまず、K562細胞、ヒトT細胞、造血幹/前駆細胞、誘導多能性幹細胞に対して遺伝子編集を行いました。エレクトロポレーション法を用いて、RNPエディターをこれらの細胞に導入しました。3〜4日後、ゲノムDNAを抽出し、ガイドRNA標的部位周辺の4〜8 kbの断片を捕捉するために長範囲PCRを実施しました。フォワードプライマーの5’末端にバーコード付きプライマーを追加し、長いアンプリコンのプール化シーケンシングを可能にしました。

実験部分とデータ分析

1. PCR最適化：KAPA HiFi DNAポリメラーゼ、NileHifi長鎖アンプリコンPCRキット、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼを比較し、PrimeSTARが特異性と収量において最も優れていることを発見しました。そのため、以降の実験ではすべてPrimeSTARを用いて長範囲PCRを実施しました。
2. データ処理および分析：Guppyを使用して初期データ処理とアダプター断片のトリミングを行いました。その後、Porechopを用いて末端の配列を切り取り、Minimap2を使用してリード配列をリファレンス配列にマッピングしました。最終的に、生成されたBAMファイルをIGVで可視化し、自作スクリプトを用いてdsODN挿入、HDR挿入、プラスミド骨格挿入、大規模欠失後の遺伝子編集結果を分析しました。

データの信頼性検証

研究では、Illuminaシーケンシングとgrepore-seqの結果を比較し、grepore-seqの短い断片挿入検出における正確性を検証しました。結果は、grepore-seqが29 bpのdsODN挿入とHDRが仲介する大規模な挿入を効果的かつ正確に検出でき、Illuminaシーケンシング結果と高い相関性を示しました。

研究結果

主な結果

1. 長範囲PCRリード配列の効果的な抽出：研究ではPCR条件を最適化し、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼを用いて4〜8 kbの断片の増幅に成功しました。
2. リード配列の完全性と精度：GuppyとPorechopを組み合わせてデータのトリミング処理を行った結果、処理後のリード配列の長さ分布がより集中し、エラー率が減少しました。
3. バーコードのデマルチプレキシング効果：grepore-seqは、複数のバーコードを持つ長いアンプリコンの処理において、Barcode_splitterと比較してより高いデータ回収率と低い偽陽性率を示しました。
4. HDRが仲介する大規模な挿入の検出：CRISPR標的部位に重なる二重切断ドナープラスミドを用いてHDR編集を行い、grepore-seqは長い断片のHDR挿入を成功裏に検出し、FACS分析結果と優れた線形相関を示しました。
5. プラスミド骨格挿入の検出：研究は一定の割合でプラスミド骨格挿入が存在することを明らかにし、NHEJ抑制実験を通じてプラスミド骨格挿入におけるNHEJ経路の役割を検証しました。

研究結論と意義

1. 科学的意義: 本研究は、CRISPR/Cas9編集後の様々な遺伝子変化を評価するための効率的かつ正確なワークフローを確立しました。grepore-seqはデータ処理とデータ分析の面で優れた性能を示すだけでなく、既存の技術では検出が困難な大規模な挿入と欠失の問題も効果的に解決します。
2. 応用価値: このワークフローは経済性とスケールの利点を持ち、遺伝子編集後の様々なゲノム変化の迅速かつ大規模な評価に適用できます。これは遺伝子編集研究と臨床応用に新しい技術的手段を提供します。

研究のハイライト

1. ワークフローの革新：長範囲PCRとナノポアシーケンシングを組み合わせ、新しいデータ処理パイプラインgrepore-seqを開発しました。
2. データの正確性：複数の最適化策とステップを通じて、データの高精度と低エラー率を確保しました。
3. 包括性：短い断片の挿入、大規模な挿入、プラスミド骨格挿入、大規模な欠失など、CRISPR/Cas9が仲介する様々な遺伝子変化を検出できます。

結論

grepore-seqは、CRISPR/Cas9遺伝子編集後の遺伝子変化検出のための堅牢かつ効率的な方法を提供します。このワークフローは科学研究実験に適用できるだけでなく、将来の臨床応用のための技術的基盤も確立しています。