阻害および刺激基質に対する相対的ミトコンドリアATP合成応答のリアルタイム評価（MitoRaise）

2025-01-21 Tue
相対的ミトコンドリアATP合成率ミトコンドリア機能 ATP ミトコンドリアDNAコピー数 MitoRaise
リアルタイムでのミトコンドリアATP合成反応を評価する新手法——MitoRaise学術的背景ミトコンドリアは細胞内のエネルギー工場であり、主に酸化的リン酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）経路を通じてアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate, ATP）を合成します。ATPは細胞エネルギーの主要な担体であり、その合成速度はミトコンドリアの機能状態を直接反映します。しかし、従来のATP測定方法は通常、単一の時点でのATPレベルを測定するか、酸素消費率（oxygen consumption rate, OCR）を通じて間接的にミトコンドリア機能を評価するものであり、ATP合成の動的変化をリアルタイムで監視することはできませんでした。特にがんなどの疾患では、ミトコンドリア代謝の異常が疾患の進行と密接に関連しているため、リアルタイムでミトコンドリアATP合成速度を監視する手法の開発が重要です。
この問題を解決するため、Sungkyunkwan UniversityとSamsung Medical Centerの研究チームは、MitoRaiseという新技術を開発し、リアルタイムでミトコンドリアATP合成速度を測定し、疾患監視における潜在的な応用価値を探求しました。
論文の出典この研究は、Eun Sol Chang、Kyoung Song、Ji-Young Songらによって共同で行われ、Sungkyunkwan UniversityやSamsung Medical Centerなど複数の機関からなる研究チームによって実施されました。論文は2024年にCancer & Metabolism誌に掲載され、タイトルは《Real-time assessment of relative mitochondrial ATP synthesis response against inhibiting and stimulating substrates (MitoRaise)》です。
研究のプロセスと結果1. MitoRaise技術の開発と検証MitoRaise技術の核心は、ATPレベルの変化をリアルタイムで監視し、ミトコンドリアATP合成速度を評価することです。研究チームはまず、細胞膜透過剤（plasma membrane permeabilizer, PMP）を使用して細胞膜を透過化し、基質が細胞内に入りミトコンドリアと反応することを可能にする蛍光信号ベースの実験プロセスを設計しました。具体的な手順は以下の通りです：
細胞膜透過化：5-10 nMのPMPを使用して細胞を処理し、細胞膜を透過化させながらミトコンドリア膜の完全性を維持します。トリパンブルー染色を通じて細胞膜透過化の程度を検証し、90%以上の細胞が透過化されていることを確認します。
ATP合成速度の測定：透過化された細胞を96ウェルプレートに播種し、アデニル酸キナーゼ阻害剤（AP5A）を含むミトコンドリア測定バッファー（MAS buffer）を添加し、その後ADPと蛍光基質（ATPlite溶液）を添加します。蛍光信号の変化を通じてATPレベルの変化をリアルタイムで監視します。
基質の刺激と抑制：基礎ATPレベルを測定した後、刺激基質（グルタミン酸やリンゴ酸など）と抑制基質（ロテノンやマロン酸など）を順次添加し、ATP合成速度の増加と減少をそれぞれ測定します。
研究チームは、一連の実験を通じてMitoRaise技術の感度と特異性を検証しました。実験結果は、MitoRaiseがさまざまな条件下でのミトコンドリアATP合成速度の変化を正確に測定できることを示しました。これには、異なる量のミトコンドリア、異なる細胞数、ミトコンドリア損傷細胞、および異質な細胞混合物が含まれます。
2. 細胞株におけるミトコンドリア機能の分析MitoRaise技術の応用可能性をさらに評価するため、研究チームは複数の乳がん細胞株およびその他の細胞株に対してミトコンドリア機能の包括的な分析を行いました。実験結果は、異なる細胞株間で総ATPレベル、ATP合成速度（ASR）、およびミトコンドリアDNAコピー数（mtDNA-CN）に顕著な差異があることを示しました。特に、MCF7やBT-474などの細胞株は高いミトコンドリア呼吸活性を示し、MDA-MB-231やBT-20などの細胞株は高い解糖活性を示しました。
相関分析を通じて、研究チームは、MCF7やBT-474などの細胞株では総ATPレベルと基質誘導ATP合成速度が正の相関を示す一方、MDA-MB-231やBT-20などの細胞株ではそのような相関が見られないことを発見しました。これは、MitoRaise技術が酸化的リン酸化に依存する細胞と解糖に依存する細胞の代謝タイプを効果的に区別できることを示しています。
3. 臨床サンプルへの応用研究チームはまた、MitoRaise技術を使用して、19名の乳がん患者と23名の健康な女性から採取した末梢血単核細胞（PBMCs）を分析しました。結果は、乳がん患者のPBMCsが低い基礎ATPレベル、ロテノン反応、マロン酸反応、およびミトコンドリアDNAコピー数を示す一方、グルタミン酸誘導ATP合成速度が健康対照群よりも顕著に高いことを示しました。これらの結果は、乳がん患者のミトコンドリア代謝状態が健康な人々と顕著に異なることを示しています。
さらに、研究チームは、年齢と基礎ATPレベル、ロテノン反応、マロン酸反応、およびミトコンドリアDNAコピー数が負の相関を示すことを発見し、ミトコンドリア機能が年齢とともに低下する可能性を示唆しました。
結論と意義MitoRaise技術は、リアルタイムでATP合成速度を監視することにより、ミトコンドリア機能を評価する新しい方法を提供します。この技術は、ミトコンドリアATP合成の動的変化を正確に測定できるだけでなく、異なる代謝タイプの細胞を区別することができ、幅広い応用可能性を持っています。特に、がん、老化、慢性疲労症候群、2型糖尿病などの疾患におけるミトコンドリア代謝研究において、MitoRaise技術は重要なツールとなる可能性があります。
研究のハイライトリアルタイム監視：MitoRaise技術はリアルタイムでミトコンドリアATP合成速度を測定し、従来の方法の限界を克服します。
高い感度と特異性：一連の検証実験を通じて、MitoRaise技術はさまざまな条件下での高い感度と特異性を示しました。
臨床応用の可能性：乳がん患者のPBMCsへの応用は、MitoRaise技術が疾患状態におけるミトコンドリア代謝の差異を効果的に区別できることを示しています。
その他の価値ある情報研究チームはまた、MitoRaise技術のさらなる最適化には、酸素消費率の測定を組み合わせて正確なリン酸酸素比（P/O ratio）を計算し、ミトコンドリア機能をより包括的に評価する必要があると指摘しています。さらに、今後の研究では、より多くの年齢層の参加者を募集し、ミトコンドリア代謝状態と年齢および疾患の関係をさらに検証する予定です。
MitoRaise技術は、ミトコンドリア研究に新しいツールを提供し、疾患の診断と治療において重要な役割を果たすことが期待されます。