高精度で蛋白フラグメントの抑制活性を予測する新方法：FragFoldの応用

学術背景

蛋白質間相互作用は細胞生命活動において重要な役割を果たし、ペプチド（peptides）や蛋白フラグメント（protein fragments）は特定の蛋白質界面に結合して、蛋白質機能を調節したり、甚至抑制剤として機能したりします。近年、高スループット実験技術の発展により、生細胞中での大量の蛋白フラグメントの抑制活性を測定することが可能になりました。しかし、これまで計算方法が存在せず、どの蛋白フラグメントが目標蛋白質と結合し、抑制作用を発揮するか、さらにはその結合モードを予測することはできませんでした。この研究領域の空白を埋めるために、研究者は新しい計算ツールを開発しました。

AlphaFoldの登場は蛋白質構造予測に革命をもたらしましたが、蛋白フラグメントと全長蛋白質の結合を予測するための応用はまだ限られていました。この空白を埋めるために、Andrew Savinovらの研究者チームは、AlphaFoldの高スループット予測能力を利用して、蛋白フラグメントの結合モードと抑制活性を大規模に予測するための計算方法であるFragFoldを開発しました。

論文の出典

この論文は、Andrew Savinov、Sebastian Swanson、Amy E. KeatingおよびGene-Wei Liによって共著され、彼らはそれぞれマサチューセッツ工科大学（MIT）の生物学部門、生物工学部門、Koch癌症研究中心に所属しています。本研究は2025年2月3日に『アメリカ国家科学院紀要』（Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS）に掲載され、タイトルは「High-throughput discovery of inhibitory protein fragments with AlphaFold」です。

研究フロー

1. FragFold方法の開発

FragFoldの核心は、AlphaFold2のモノマーモデルの重みを使用し、ColabFoldプラットフォームを通じて蛋白フラグメントと全長蛋白質の結合を高スループットで予測することです。モデル訓練中に天然の蛋白結合データを記憶しないようにするために、研究者は単鎖データのみに基づいて訓練されたAlphaFold2モノマーモデルを選択しました。多配列アラインメント（MSA）の生成を加速するために、研究者は従来のMSA生成ステップを最適化し、全長蛋白のMSAを事前に生成し、これをトリミングして各フラグメントに対応するMSAを生成しました。これらのMSAはその後AlphaFold2に入力され、蛋白フラグメントと目標蛋白の結合モデルが生成されます。

FragFoldの革新点は、AlphaFoldの信頼度指標（pLDDTやipTMなど）に依存せず、AlphaFoldが生成した構造モデル中の結合接触点（n_contacts）に注目し、ipTMスコアを組み合わせて重み付けを行い、予測結合ピークを生成することです。これにより、FragFoldは蛋白フラグメントの結合モードをより正確に予測することができます。

2. 既知の蛋白質インターフェースへの適用

研究者はまず、既知の蛋白-蛋白相互作用インターフェース、特にE. coliのFtsZ蛋白にFragFoldを適用しました。FtsZは細胞分裂に関連する構造蛋白であり、そのポリマー化インターフェースの複数の領域が既に実験的に抑制活性を持つことが証明されています。FragFoldはこれらの抑制活性ピークに対応する結合ピークを成功裏に予測し、予測された結合モードは実験的に決定された天然の結合モードと非常に一致していました。特に、FragFoldが予測した結合モードは主要な4つの抑制ピーク（1、1’、2、2’）において、結晶構造と類似の空間構造を示し、RMSD（平均二乗偏差）はすべて3 Å未満でした。

3. 多様な蛋白質への適用

FragFoldの汎用性を検証するために、研究者は50Sリボソーム亜基蛋白L7/L12、DNAジンナーゼ亜基A（GyrA）、シングルストランドDNA結合蛋白（SSB）など、構造と機能が異なる多くの蛋白質にFragFoldを適用しました。これらの蛋白質でも、FragFoldは高い予測精度を示し、既知の蛋白インターフェース抑制フラグメントの87%の結合モードを成功裏に予測しました。例えば、L7/L12蛋白の二量体化ドメインフラグメントはL7/L12との結合が予測され、そのRMSDは1.2 Å、天然結合モードとの類似度は93%でした。

4. 未知の結合モードの予測

FragFoldのもう一つの重要な応用は未知の蛋白フラグメント結合モードを予測することです。研究者は、結晶構造で解析されていないが、細胞分裂プロセスでFtsA、MinC、ZipAなどの蛋白質と相互作用することが知られているFtsZ蛋白のC端無秩序尾（intrinsically disordered tail）にFragFoldを適用しました。FragFoldは成功裏にFtsZ C端フラグメントとこれらの蛋白質の結合モードを予測し、既存の遺伝的および生化学的データと高度に一致しました。例えば、FragFoldはFtsZ C端フラグメントがFtsZのGTPase活性部位に結合し、近接するFtsZモノマーのT7ループとの結合を阻止すると予測しました。この予測は分子動力学シミュレーションの結果と一致していました。

5. 深度変異スキャンによる検証

FragFoldの予測結合モードをさらに検証するために、研究者は複数の抑制フラグメントに対して深度変異スキャン（deep mutational scanning）を行いました。各フラグメントの各残基を変異させ、その抑制活性の変化を生細胞中で測定することで、研究者はFragFoldが予測した重要な結合残基が変異後に抑制活性に顕著な影響を及ぼすことを発見しました。例えば、FtsZフラグメントのいくつかの残基の変異により、その抑制活性が大幅に低下し、他の残基の変異では逆に抑制活性が強まりました。これらの実験結果は、FragFoldの予測結合モードの正確性をさらに支持しています。

主要な結果と結論

FragFoldは、既知の蛋白-蛋白相互作用インターフェースにおいて87%の予測精度で、複数の蛋白フラグメントの結合モードと抑制活性を成功裏に予測しました。さらに、FragFoldは未知の結合モードを予測することができ、例えばFtsZ C端無秩序尾とFtsA、MinC、ZipAとの相互作用を予測しました。これらの予測は既存の遺伝的および生化学的データと一致し、これらの蛋白質の制御メカニズムに対する新しい分子モデルを提供しました。

深度変異スキャン実験はFragFoldの予測精度をさらに検証し、蛋白フラグメント内の重要な残基がその抑制機能に果たす役割を明らかにしました。これらの実験結果は、FragFoldの予測能力を支持するとともに、効率的な蛋白抑制剤の設計に重要な実験的根拠を提供しました。

研究の意義と価値

FragFoldの開発は、蛋白フラグメント抑制剤の大規模発見のために強力な計算ツールを提供します。AlphaFoldの高精度構造予測能力と高スループット実験データを組み合わせることで、FragFoldは蛋白フラグメントの結合モードと抑制活性を正確に予測できます。この手法は、研究者が蛋白フラグメントの機能メカニズムを深く理解するだけでなく、医薬品開発にも新たな道を開きます。例えば、抑制活性を持つ蛋白フラグメントを予測し、選別することで、新型ペプチド薬の開発プロセスを加速できます。

さらに、FragFoldの自動化予測フローは、将来のプロテオミクス（proteomics）研究に新たなツールを提供します。全プロテオーム中の機能性蛋白フラグメントを系統的にスキャンすることで、FragFoldは多くの蛋白相互作用ネットワークを明らかにし、細胞生命活動の制御メカニズムについて新たな洞察を提供する可能性があります。

研究のハイライト

1. 高精度：FragFoldは既知の蛋白インターフェースでの予測精度が87%に達し、未知の結合モードも予測できます。
2. 自動化フロー：FragFoldは自動化予測フローを通じて、全プロテオーム中の抑制フラグメントを効率的にスキャンできます。
3. 実験検証：深度変異スキャン実験はFragFoldの予測結果をさらに検証し、重要な残基の機能的役割を明らかにしました。
4. 幅広い応用：FragFoldは既知の蛋白インターフェースだけでなく、無秩序蛋白領域の結合モードも予測できるため、蛋白質機能研究に新たなツールを提供します。

FragFoldの開発は、蛋白フラグメント予測分野における重要な進展を示し、今後の研究と応用に広い展望を提供しています。