トランスクリプトーム技術によるシーケンス追跡（Tracking-Seq）によるCRISPR-Cas9媒介遺伝子編集のオフターゲット効果の多様性の解明

研究背景

遺伝子編集技術の急速な発展に伴い、CRISPR-Cas9システムはその高効率と操作の簡便さから生物医学研究分野で広く利用されています。しかし、CRISPR-Cas9システムがDNAを編集する際には、想定外の遺伝子座を切断するオフターゲット効果が発生する可能性があり、これを全面的に識別し評価することが重要な課題となっています。これまでの研究では、細胞遊離法などを用いてオフターゲット効果を検出してきましたが、これらの方法には特定の編集ツールや細胞タイプへの依存性、多量の細胞が必要、偽陽性率が高い、および体外での遺伝子編集に限られるなどの制限があります。したがって、細胞内で直接オフターゲット効果を検出できる汎用的な方法の開発が急務です。さらに、現在の研究では編集ツールのターゲティングの多様性、すなわち異なる編集ツールが異なる細胞タイプ間で異なるオフターゲット効果を示す可能性があることが見落とされており、これは臨床治療では特に重要です。したがって、新しい技術プラットフォームは、さまざまな編集ツールのオフターゲット効果の検出に適用できるだけでなく、異なる細胞タイプにも対応し、さまざまな研究と応用シナリオに適応する必要があります。

論文情報

この研究はMing Zhu、Runda Xu、Junsong Yuanらが共同で行い、清華大学生命科学学院のTsinghua-Peking Joint Center for Life Sciences、医学院基礎医学科、生物情報学教育部重点実験室、IDG/McGovern Institute for Brain Research、システム合成生物学センター、清華大学薬学院、生命学院、北京市分子腫瘍共同実験室など複数の研究機関に所属しています。この論文は2024年に『Nature Biotechnology』誌に発表されました。

研究詳細

操作手順

研究は以下の4つの主要ステップから構成されています：

a) Cut&Run技術を利用してRPA結合の一本鎖DNA（ssDNA）を捕捉。 b) HL-dsDNaseを用いて二本鎖DNA（dsDNA）を特異的に除去し、ssDNAを濃縮。 c) 特異的なssDNAライブラリーを構築。 d) 次世代シーケンシング（NGS）とOfftrackerソフトウェアを用いたバイオインフォマティクス解析。

研究成果

編集後の細胞をシーケンス解析した結果、研究チームはTracking-SeqがRPA結合のssDNAを効果的に捕捉することを示しました。低い細胞投入率でも、ターゲットおよびオフターゲットの遺伝子座の編集活動を検出することに成功しました。時系列分析により、異なる編集ツールのTracking-Seq信号の動態が異なることが示されました。

研究結論

研究で提案されたTracking-Seq技術は高感度と実用性を示しており、多くの一般的な遺伝子編集ツールに広く適用できることが確認されました。この技術は体外実験だけでなく、体内遺伝子編集のシナリオにも適用可能です。

研究ハイライト

Tracking-Seq技術は、低い細胞投入でのオフターゲット効果の直接検出を実現するだけでなく、同一ガイドRNAが異なる編集モードや異なる細胞タイプで示すオフターゲット効果の多様性を明らかにしました。これらの発見は、オフターゲット効果を元のシステム内で原位測定する必要性を強調しています。

その他の情報

本研究はデータ解析に使用するアルゴリズムも開発し、異なる編集ツールに対するオフターゲット効果の双方向的な変化傾向を示しました。また、異なる細胞タイプでの編集効率に多様性があることを発見し、代替細胞系でのオフターゲット効果の評価が不十分であることを示唆しました。これにより、体内および体外での応用においてリスクが存在する可能性があります。

結論

この研究は、CRISPR-Cas9およびその他の遺伝子編集ツールのオフターゲット効果を検出するための有効な技術を提供するだけでなく、研究者が高リスクの臨床応用前に包括的なリスク評価を行うための重要な基盤を提供します。これにより、遺伝子編集技術が臨床応用へのスムーズな移行を支援するものとなります。