ヒト超酸化物ジスムターゼ1集合体の家族性および散発性筋萎縮性側索硬化症患者の死後神経組織におけるシード活性検出

背景紹介

筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）は、急速に進行する神経変性疾患であり、患者は診断後平均2〜5年の生存期間となる。ALSの主な症状には筋肉のけいれん、筋疲労、けいれんおよび筋力低下があり、後期症状には体重減少、無言症および麻痺が含まれ、呼吸不全が主な致死原因である。ALSの病因は複雑で、約90%のALS症例は散発性（sporadic ALS, sALS）であり、残りの10%は遺伝性の家族性（familial ALS, fALS）である。以前の研究では、ALS患者の神経組織に金属タンパク質ヒト超酸化物ジスムターゼ1（Superoxide Dismutase 1, SOD1）の集合体が現れることが示されており、SOD1遺伝子変異に関連する家族性ALS患者では特に顕著である。また、他の形式のALS、染色体9開放読枠72（C9ORF72）遺伝子の異常拡張に関連する最も一般的な家族性ALSおよび散発性ALSでもSOD1集合体が検出されている。

現在の研究では、SOD1集合体がプリオン様のシード伝播特性を持つ可能性が示唆されており、新しい診断方法の開発が求められている。これにより、ALS病理におけるSOD1の動態特性をより深く理解し、ALSのバイオマーカーとしての潜在的な応用価値を評価することができる。この背景下で、本研究はリアルタイム振動誘起変換（real-time quaking-induced conversion, RT-QuIC）技術に基づくシード増幅検出法を開発し、ALS患者の死後脊髄および大脳運動皮質組織からのSOD1シード活性を測定することを目的としている。

論文の出典と著者情報

この研究は、Justin K. Mielke、Mikael Klingeborn、Eric P. Schultz、Erin L. Markham、Emily D. Reese、Parvez Alam、Ian R. Mackenzie、Cindy V. Ly、Byron CaugheyおよびNeil R. Cashmanらによって共同執筆されており、所属機関にはMcLaughlin研究所、モンタナ大学、ロッキーマウンテン研究所、ブリティッシュコロンビア大学およびワシントン大学が含まれる。論文は2024年《Acta Neuropathologica》第147巻第100ページに発表され、2024年2月1日に初稿を受け取り、2024年6月6日に改訂され、6月7日に正式に受理された。

研究方法

ワークフロー

本研究のワークフローには以下の主なステップが含まれる：

1. ヒトSOD1プラスミドの調製と精製：研究チームは全長ヒトSOD1遺伝子を含むプラスミドを構築し、E. coli株BL21（DE3）で発現させて精製した。金属イオン親和性クロマトグラフィーなどの精製技術を使用して、発現したSOD1の質を確認した。

2. ヒト死後脊髄および運動皮質組織の調製と処理：研究チームはALS患者および健康対照群から頸椎および胸椎脊髄および運動皮質を含む組織を抽出し、さまざまな濃度勾配の組織ホモジェネートを調製した。

3. 免疫捕獲実験：特定の抗SOD1抗体を用いて磁気ビーズを架橋し、RT-QuIC検出の特異性を制御するためにこの抗体で集合したSOD1を捕獲した。

4. SOD1 RT-QuIC検出：研究チームは新しいSOD1 RT-QuIC検出法を開発し、最適化された反応系（例：SOD1基質、GuHCl、酢酸ナトリウムおよびThTを含む鍵反応バッファ成分）を使用して微孔板で検出を実施し、蛍光強度で集合反応の進行を測定した。

5. 透過型電子顕微鏡分析：RT-QuICによって生成された集合物がアミロイドフィブリルであることを確認するために、研究チームは透過型電子顕微鏡を使用して集合物の形態を観察した。

6. データ分析および統計：RT-QuIC曲線をフィットさせることで蛍光増強値およびラグフェーズを計算し、さまざまなALS症例タイプ間の差異を分析した。

サンプルおよび実験対象

1. 全米健康研究所（NIH）から提供された散発性ALSおよび対照（胸椎脊髄および運動皮質）。
2. ジョージタウン大学の全米脳バンク（Georgetown Brain Bank）から提供された家族性ALS脊髄組織サンプル。
3. UBCのIan MackenzieとCindy Lyチームおよびワシントン大学の他の神経学対照サンプル。
4. 複数の研究室から取得されたデータに基づく繰り返しおよび対照実験、データの信頼性と正確性の保証。

研究結果

SOD1基質特性の検出

SOD1のRT-QuIC反応系により、ALS患者の組織中ではSOD1集合体が蛍光強度を顕著に増加させることが発見されたが、健康対照群にはその現象は見られなかった。これはこれらのSOD1集合体が自己複製および伝播特性を持つことを示している。

異なるALSタイプ患者のRT-QuIC検査結果

1. 家族性ALS（SOD1変異）：これらの患者の脊髄および運動皮質組織中に大量のSOD1集合体が存在し、ラグフェーズが短く、高蛍光強度を示した。
2. 家族性ALS（C9ORF72変異）：対応するSOD1集合体が検出され、SOD1変異患者に類似した伝播特性を示した。
3. 散発性ALS：散発性ALS患者の組織中でもSOD1集合体が検出され、これらの患者ではwt SOD1が朊病毒様自己伝播能力を持つことが示されている。

異なる解剖部位のSOD1シード活性

異なる解剖部位（例：胸椎脊髄および運動皮質）を比較すると、運動皮質のSOD1シード活性が脊髄よりも顕著に高いことが示され、ALS病理過程の神経退行率が解剖位置と密接に関連していることが明らかになった。

結論と意義

本研究は、RT-QuICに基づくSOD1シード活性検出法を開発および検証し、ALS患者の神経組織中のSOD1集合体を正確に検出できることを示した。この方法はALSのバイオマーカーとしての潜在能力を示し、特に散発性ALS患者にとって重要な診断および研究意義がある。さらに最適化および応用することで、ALSの早期診断および治療効果の評価に新しいツールを提供できる可能性がある。

研究のハイライト

1. 新しい方法の開発：本研究は、RT-QuIC技術に基づくALS関連SOD1シード活性検出法を初めて開発し、高い感度と特異性を持つことを示した。
2. 多様なALSタイプの検出：この方法が多様なALS病理タイプに適用可能であり、各ALSタイプの病理メカニズムについて新たな証拠を提供した。
3. 解剖特異的差異：ALS患者組織の異なる解剖部位でSOD1シード活性に顕著な差異があることを発見し、ALS病理の拡張メカニズムに新たな視点を提供した。

今後の展望

この研究に基づき、次のステップとして生体患者から得られる生物サンプルへの応用可能性を探るとともに、異なるALSタイプ間の共通点および差異を研究し続けることで、この複雑な疾患の発病機構をよりよく理解し、ターゲットを絞った治療戦略を開発することを目指す。