4-1BBコード化CARはユビキチン修飾酵素A20の隔離を介して細胞死を引き起こす

2024-08-01 Thu
キメラ抗原受容体 CAR-T細胞 4-1BB アポトーシスネクロプトーシス A20 NF-κB
背景紹介キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T細胞）は、特定の血液悪性腫瘍に対する免疫療法において大きな可能性を示しています。しかし、CAR分子に含まれるCD28および4-1BB共刺激ドメインがCAR-T細胞でどのように機能するかは、まだ完全に理解されていません。CD28と4-1BBドメインは、CAR-T細胞で著しく異なるリン酸化パターンを示します。これは、CD28共刺激を介したCAR-T細胞がより速く腫瘍を殺傷し、4-1BBを介したものがより遅い効果を示す理由の一部を説明する可能性があります。さらに、4-1BB共刺激のCAR-T細胞は、通常、T細胞の持続性、代謝適応、およびメモリー形成の向上と関連していますが、T細胞アポトーシスのリスクが増加します。CD28と4-1BBドメインのCAR-T細胞における分子相互作用を探ることは、CAR-T細胞の設計を最適化するために非常に重要です。
論文の出典本研究は、Zhangqi Douらの研究者によって行われました。研究者は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のLineberger総合がんセンター、浙江大学医学部第二附属病院脳神経外科、およびその他の複数の部門に所属しています。論文は2024年6月27日に「Cellular & Molecular Immunology」誌にオンラインで発表されました。
研究詳細研究プロセス研究者はまず、CD19抗原を特異的に認識するCARを構築し、それぞれCD28（19.cd28ζ）および4-1BB（19.bbζ）ドメインを含むものを作成しました。これらをガンマレトロウイルス遺伝子導入によって活性化したヒトT細胞で発現させました。研究では、19.bbζ CAR-T細胞が培養過程で大きな細胞凝集体を形成し、より多くのAnnexin-V陽性細胞を示すことが明らかになりました。これは細胞死（アポトーシスおよびネクロプトーシス）の増加と関連しています。
これらの観察結果がCAR-T細胞の自己凝集によるものかどうかを調べるために、研究者は共焦点顕微鏡を用いて観察を行いました。19.cd28ζおよび19.bbζ CAR-T細胞は細胞表面に同様の分布を示すことが分かりました。さらに、異なる抗体のCARは細胞凝集とAnnexin-V発現に関して同様の結果を示しました。
研究はさらに、4-1BBのTRAF結合ドメインの過剰発現や削除などの遺伝子操作を通じて、A20の役割を探りました。研究は、4-1BBのTRAF結合ドメインを除去することで、細胞凝集と細胞死を減少させ、4-1BB共刺激CAR-T細胞の抗腫瘍能力を向上させることができることを示しました。
主な結果4-1BBシグナルがCAR-T細胞の凝集と細胞死を引き起こす：19.cd28ζ CAR-T細胞と比較して、19.bbζ CAR-T細胞はより大きな細胞凝集体を形成し、より高いAnnexin-V陽性細胞比率を示しました。
4-1BB共刺激がアポトーシスとネクロプトーシスを誘導する：培養過程で、19.bbζ CAR-T細胞は初期および後期アポトーシス細胞の割合が高く、RIPK1およびRIPK3のリン酸化の増加を示し、ネクロプトーシスの存在を示唆しました。
NF-κBシグナル経路の活性化：19.bbζ CAR-T細胞はNF-κBシグナル経路の高い活性を示し、具体的にはIKKα/βとP65のリン酸化の増加、およびICAM-1の過剰発現として現れました。NF-κBシグナル経路の過剰活性化は細胞凝集と細胞死につながりました。
A20の役割：NF-κB経路の重要な負の調節因子であるA20は、19.bbζ CAR-T細胞で異常な局在と機能不全を示しました。A20の過剰発現により、細胞死と細胞凝集を減少させ、CAR-T細胞の増殖能力を回復させることができました。
免疫沈降と質量分析：質量分析により、TRAF2/3が19.bbζ CARでより豊富であり、A20はほぼ19.bbζ CARのみで捕捉されることが示され、A20が4-1BB共刺激で重要な役割を果たしていることがさらに示唆されました。
研究結論この研究は、4-1BB共刺激ドメインがCAR-T細胞で引き起こす細胞凝集と細胞死がNF-κB/A20シグナル経路と密接に関連していることを示しています。A20の過剰発現や4-1BBのTRAF結合配列の削除により、細胞凝集と細胞死を効果的に減少させ、CAR-T細胞の抗腫瘍効果を向上させることができます。
研究のハイライト4-1BB共刺激がCAR-T細胞で細胞凝集と死を引き起こすメカニズムを解明：研究は4-1BB共刺激がTRAFを介したA20の機能不全を引き起こし、NF-κBシグナル経路の過剰活性化を導き、アポトーシスとネクロプトーシスを引き起こすことを示しました。
CAR-T細胞設計を改善する新戦略を提案：4-1BBのTRAF結合ドメインの削除やA20の過剰発現により、4-1BB共刺激CAR-T細胞の抗腫瘍能力を大幅に向上させることができます。
将来のCAR-T細胞療法に新しいアプローチを提供：研究結果は、CAR-T細胞の設計を最適化し、その治療効果を向上させ、副作用を減少させるのに役立ちます。
研究の価値本研究は4-1BB共刺激の分子メカニズムに新しい洞察を提供し、A20の調節を通じてCAR-T細胞の設計を最適化し、その抗腫瘍効果を向上させる新戦略を提案しています。これらの発見は重要な科学的価値を持つだけでなく、CAR-T細胞の臨床応用に新しいアプローチを提供し、顕著な応用価値を持っています。
備考研究で使用されたすべての実験方法と材料（細胞株、プラスミド構築、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡イメージング、細胞共培養実験、免疫沈降、質量分析、定量PCR、NF-κBレポーター遺伝子アッセイ、CAR-T細胞増殖実験、RNAシーケンシング）は原文で詳細に記述されています。
関連データと結果の具体的な統計分析方法と結果は報告書に詳細に記載されています。