研究报告：基于TLS相关基因构建的口腔鳞状细胞癌预后模型的验证与分析

背景与研究动机

口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）是头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC）中最常见的亚型，具备高度的淋巴结转移倾向，尤其易于向颈部淋巴结扩散。根据2022年全球癌症观测报告（GCO），OSCC的新发病例数约为38万，其中因该疾病死亡的人数接近18.8万。GCO预计该病的发病率与死亡率到2040年仍将持续增长。目前，OSCC患者的预后主要通过评估肿瘤尺寸、淋巴结状况及远处转移情况来判断，即TNM分期系统。然而，即使处于相同TNM分期的患者，其预后差异显著，这反映出TNM分期在捕捉OSCC的免疫异质性方面存在不足之处。

近年来，三类淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures，TLS）因在非淋巴组织中形成的免疫调节作用及其对癌症患者预后的正面影响而受到广泛关注。TLS通常直接暴露于肿瘤微环境中，比其他非浸润性淋巴细胞具备更强的特异性免疫反应。在OSCC领域，TLS作为一种创新性预后指标的潜力已初步得到证实。TLS的存在与OSCC患者的总体生存率（Overall Survival，OS）及无病生存率（Disease-Free Survival，DFS）呈正相关，有望在术后临床结果预测中发挥补充作用。然而，由于TLS在临床实践中尚无推荐的分子标志物，其在帮助临床医生制定个性化治疗方案方面的应用仍受限。

研究来源

本研究由Bincan Sun等人完成，主要作者来自中南大学湘雅医院口腔颌面外科及相关研究机构。文章于2024年发表在《Cancer Cell International》期刊上。

研究方法

1. TLS检测与量化

研究首先应用卷积神经网络（Convolutional Neural Network，CNN）来检测并量化HE染色的OSCC全切片图像中的TLS分布及面积。采用经过改良的DeepLab V3+ CNN来检测TLS候选区域，并应用主动轮廓模型优化其边界，通过计算淋巴细胞数量、TLS区域大小及密度，将候选区域最终识别为TLS。在图像中，研究人员将TLS分为三种类型：不明确的淋巴聚集体（Aggregates，AGG）、缺少生发中心的原始淋巴滤泡样TLS（Primary Follicle-Like TLS，FL1）以及形成生发中心的成熟淋巴滤泡样TLS（Secondary Follicle-Like TLS，FL2）。

2. TLS相关基因（TLS-Related Genes，TLSRGs）筛选

通过对TCGA数据库中336例OSCC样本进行差异基因表达分析（Differentially Expressed Genes，DEGs），筛选出与TLS相关的基因。进一步通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）功能富集分析揭示了TLSRGs在化学趋化因子信号通路、树突状细胞抗原处理及呈递中的关键作用。

3. 构建预后评分模型与预测列线图

研究通过单变量及多变量Cox回归分析评估TLSRGs与OS的关系，并运用Lasso和逐步回归筛选出CCR7、CXCR5及CD86这三个关键基因构建风险评分模型。风险评分公式为： [ \text{风险评分} = (0.3169 \times \text{CD86表达量}) + (-1.3345 \times \text{CXCR5表达量}) + (-0.2974 \times \text{CCR7表达量}) ] 基于此模型，患者被划分为高风险和低风险组，并通过Kaplan-Meier（K-M）生存曲线及ROC曲线分析其预后准确性。此外，研究还引入其他临床变量构建个性化的预后预测列线图，以进一步提升模型的临床应用价值。

4. TLS、免疫细胞浸润与风险评分的关系

利用Tumor Immune Estimation Resource（Timer）工具分析TLS与免疫细胞浸润特征的关系。研究发现，TLS+组的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞均显著高于TLS-组，表明TLS在肿瘤微环境中发挥重要免疫作用。同时，TLS区域比例与风险评分呈负相关，显示出TLS的存在与免疫细胞浸润、风险评分及淋巴结转移呈现负相关关系。

研究结果

TLS在OSCC预后中的独立作用

本研究通过多种统计分析方法验证了TLS在OSCC患者OS和DFS预后中的积极影响。K-M生存分析显示，TLS+组的OS和DFS显著优于TLS-组，而TLS的成熟程度和面积比例与预后关系更密切，TLS面积较大者具备更佳预后。

TLSRGs在风险预测模型中的作用

通过Cox回归和Lasso分析筛选出的CCR7、CXCR5和CD86显著影响OSCC患者的预后，三基因模型的构建进一步增强了预测能力。尤其是CXCR5和CCR7在免疫细胞迁移、淋巴组织生成及维持方面的关键作用在TLS形成和抗肿瘤免疫中不可或缺，而CD86的下调抑制了T细胞活化。

风险评分与免疫细胞浸润的关系

TLS在OSCC中的存在与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞的浸润密切相关，这些免疫细胞在抗肿瘤免疫中扮演重要角色。研究指出，TLS高比例与免疫细胞浸润成正相关，反映出TLS在免疫防御中的重要性。同时，研究还发现CXCR5和CCR7的上调、CD86和风险评分的下调均与淋巴结转移呈负相关关系。

研究的创新与意义

1. 方法创新性：本研究首次应用卷积神经网络对OSCC样本中的TLS进行自动化检测和量化，使得TLS的评估更加高效和准确。此外，通过TLSRGs构建的风险评分模型也为患者的个体化评估提供了新的可能。
2. 预后价值：研究指出TLS+患者的预后显著优于TLS-患者，尤其是TLS的面积比例比成熟度更具预测价值。三基因模型的建立进一步增强了风险预测的敏感性和特异性，为OSCC患者的分级和预后提供了新的参考。
3. 模型的个性化应用：基于风险评分的列线图结合临床变量为个体化治疗方案提供了依据，可在一定程度上改善现有的分期系统和风险分层模式。

结论

此研究建立的基于TLSRGs的OSCC预测模型和个体化列线图，为OSCC的临床应用提供了科学依据。与之前的研究相比，本研究优势显著：通过卷积神经网络自动识别TLS，为影像分析技术在肿瘤预后中的应用提供了可能；探索了TLS与淋巴结转移和免疫细胞浸润的关系，首次构建了基于TLSRGs的OSCC列线图预测模型。TLS在OSCC中的分布和面积可以作为有效的预后标志物和免疫治疗的反应预测指标，为未来OSCC患者的精准治疗提供了理论支持。