基于长读长测序的多重耐药微生物基因组监测

2025-01-08 Wed
基于长读长测序的多重耐药微生物基因组监测研究学术背景多重耐药微生物（Multidrug-Resistant Organisms, MDROs）是全球公共卫生的重大威胁。这些微生物对多种抗生素产生耐药性，导致感染难以治疗，增加了医疗负担。为了有效监测和控制MDROs的传播，准确识别其耐药基因、分子类型变化以及传播路径至关重要。传统的分子分型方法，如脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE）和多位点序列分型（Multi-Locus Sequence Typing, MLST），虽然在过去发挥了重要作用，但其分辨率较低、操作复杂且成本高昂。近年来，基于全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）的方法逐渐成为主流，尤其是短读长测序技术（如Illumina平台）在基因组监测中广泛应用。然而，短读长测序在检测结构变异（如大片段插入、缺失、重复序列等）方面存在局限性，难以完整组装细菌基因组。
长读长测序技术（如Oxford Nanopore Technologies的纳米孔测序）因其能够生成较长的DNA片段，逐渐成为短读长测序的有力替代方案。长读长测序不仅能够提高基因组组装的完整性，还能更准确地检测耐药基因和质粒结构。因此，本研究旨在评估基于长读长测序的基因组监测方法在MDROs分型和传播分析中的准确性和适用性。
论文来源本论文由Fabian Landman、Casper Jamin等作者共同完成，作者来自荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）。论文于2024年发表在Genome Medicine期刊上，题为《Genomic surveillance of multidrug-resistant organisms based on long-read sequencing》。
研究流程1. 样本选择与DNA提取研究选取了356株MDROs，包括106株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、85株大肠杆菌（Escherichia coli）、15株阴沟肠杆菌复合体（Enterobacter cloacae complex）、10株弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、34株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、16株鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和69株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA），其中24株MRSA来自一次暴发事件。所有样本的基因组DNA通过Maxwell® RSC48自动化提取平台进行提取。
2. 测序与数据分析所有样本分别进行了短读长（Illumina NextSeq 550）和长读长（Nanopore Rapid Barcoding Kit-24-v14, R10.4.1）全基因组测序。长读长测序数据使用Dorado-0.3.2进行碱基识别，并通过Flye、Canu、Miniasm、Unicycler、NECAT、Raven和Redbean等多种组装工具进行基因组组装。短读长测序数据则使用Juno-assembly v2.0.2流程进行组装。
3. 分子分型与耐药基因检测研究使用多位点序列分型（MLST）、全基因组多位点序列分型（Whole-Genome MLST, wgMLST）、全基因组单核苷酸多态性（Whole-Genome Single-Nucleotide Polymorphisms, wgSNP）等方法对长读长和短读长测序数据进行比较。此外，还通过ResFinder和PlasmidFinder数据库检测耐药基因和质粒复制子。
主要结果1. 长读长测序与短读长测序的比较研究结果显示，长读长测序在大多数MDROs中的wgMLST分型与短读长测序结果高度一致，差异仅在1到9个等位基因之间。然而，铜绿假单胞菌的长读长测序结果与短读长测序结果差异较大，最多相差27个等位基因。MLST分型和MLVA分型在长读长和短读长测序数据中完全一致。
2. 耐药基因检测长读长测序在耐药基因检测方面表现出高灵敏度和特异性（92-100%/99-100%）。研究还发现，长读长测序能够更准确地检测多拷贝耐药基因和质粒结构，尤其是在MRSA暴发事件中，长读长测序成功识别了与短读长测序一致的耐药基因和质粒复制子。
3. MRSA暴发分析研究通过长读长测序成功分析了荷兰中部地区的一次MRSA暴发事件。长读长测序数据与短读长测序数据在wgMLST分型、MLST分型和MLVA分型上高度一致，表明长读长测序在暴发事件分析中具有较高的准确性。
结论研究表明，基于长读长测序的基因组监测方法在MDROs的分型、耐药基因检测和暴发分析中具有与短读长测序相当的准确性。长读长测序不仅能够提供更完整的基因组组装，还能更准确地检测结构变异和多拷贝耐药基因。此外，长读长测序的低成本和快速文库制备使其在资源有限的环境中具有广泛的应用前景。
研究亮点高准确性：长读长测序在大多数MDROs中的分型结果与短读长测序高度一致，表明其在基因组监测中的可靠性。
耐药基因检测：长读长测序在耐药基因检测方面表现出高灵敏度和特异性，尤其在检测多拷贝基因和质粒结构方面具有优势。
暴发分析：长读长测序成功应用于MRSA暴发事件的分析，展示了其在流行病学调查中的潜力。
低成本与快速制备：长读长测序的低成本和快速文库制备使其在资源有限的环境中具有广泛的应用前景。
研究意义本研究为MDROs的基因组监测提供了一种高效、低成本的长读长测序方法。该方法不仅能够提高基因组组装的完整性，还能更准确地检测耐药基因和质粒结构，为MDROs的传播控制和感染预防提供了重要的技术支持。此外，长读长测序的低成本和快速制备特性使其在资源有限的国家和地区具有广泛的应用潜力，有助于全球范围内的MDROs监测和控制。