遗传性听力损失中的遗传异质性：Kinociliary蛋白TOGARAM2的潜在作用

2024-08-06 Tue
遗传异质性遗传性听力损失 TOGARAM2 候选基因生物信息学分析耳蜗毛细胞双重听力损失
遗传性听力损失中的基因多样性：KINOCILIARY蛋白TOGARAM2的潜在作用背景介绍
听力损失（Hearing Loss, HL）是一种病因众多的特征，目前研究已经发现超过200个基因中的致病变异与HL相关。尽管已有广泛研究，但超过三分之一的家族中仍无法找到致病原因，这给基因分析带来了极大的挑战，在多基因家族中尤其明显。多个不同基因变异可能导致不同个体，即使是同一个家系中的各成员，各自的致病原因也不尽相同。因此，寻找更多潜在的耳聋致病变异至关重要。
论文来源
本文研究由Memoona Ramzan、Mohammad Faraz Zafeer、Clemer Abad、Shengru Guo等学者完成，研究所属机构分别包括美国迈阿密大学、德国Göttingen大学等。论文发表在2024年2月19日的《European Journal of Human Genetics》上，详细文献DOI为10.1038/s41431-024-01562-6。
研究目的
本文的研究目的在于通过对四个多基因家系进行外显子组或全基因组测序，确认隐藏于已知或新候选耳聋基因中的其他变异。特别是，研究TOGARAM2变异作为常染色体隐性非综合征型HL潜在致病原因的角色，通过展示它在家族中的存在、耳蜗中的表达以及其在耳蜗毛细胞中的蛋白定位，来明确这些变异的致病原因。
研究方法
伦理声明及研究参与者
四个家族成为了国际合作队列研究的部分，具体目的是识别与听力损失相关的基因。研究获得了多个机构的伦理委员会批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。对于未成年参与者，其同意书由父母提供。对成人的听力测试在隔音室内进行，对未成年人的听力测试遵循标准操作程序。
基因分析
研究首先对每个家族中所有受影响成员进行了GJB2（MIM 121011）的双等位基因变异筛查。对每个家族中的先证者进行了外显子组测序（Exome Sequencing, ES），并对部分受影响个体进行了全基因组测序（Genome Sequencing, GS）。基因组数据与人类GRCh37/hg19基因组组装进行比对，变异调用则使用GATK软件包进行。通过自家软件对已知耳聋基因中的单核苷酸变异、插入缺失变异以及拷贝数变异（Copy Number Variants, CNVs）进行分析。部分未解决的家系成员通过GS进一步分析。
TOGARAM2变异在HEK293细胞中的生成
为了生成特定的TOGARAM2变异c.1543C>T (p.Gln515Ter)，在HEK293细胞中特异性gRNA和修复供体由IDT公司购买并进行编辑。通过使用4D-Nucleofector系统进行细胞电转，成功生成并确认了TOGARAM2变异细胞后，通过Sanger测序进行验证。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）
从三种单克隆同源正常对照和三种单克隆TOGARAM2 (c.1543C>T)敲入细胞中提取RNA并反转录合成cDNA。使用SYBR Green染料进行mRNA表达分析，HPRT1用作内控。
主要结果
四个家族中的所有成员都表现出先天性或语言前持续的双侧重度至极重度HL。其中，在家族1596中，发现有三名受影响的兄弟姐妹是MARVELD2基因中c.1331+2 T>C变异的纯合子，但其余未显示此变异的成员通过全基因组测序鉴定出TECTA基因中的c.569 C>T (p.Thr190Met)新变异。
在家族2503中，发现SLC26A4基因中的c.1334 T>G (p.Leu445Trp)变异无法解释所有受影响成员的HL症状。进一步的外显子组测序表明SOX10基因中c.89G>T (p.Ser30Ter)可能也是致病原因之一。
另外，在家族2450中，一个受影响的兄弟姐妹中发现了MYO15A基因中的c.4441 T>C (p.Ser1481Pro)变异。对没有该变异的兄弟姐妹进行了全基因组测序，识别出TOGARAM2基因中的c.1543 C>T (p.Gln515Ter)变异，并推测该变异可能导致nonsense介导的mRNA降解（NMD）。
研究结论
本研究表明对多基因家系的各个受影响成员进行个别分析是一种有效的方法，有助于识别已知和新候选基因中的致病变异。特别是，发现了TOGARAM2基因变异在耳蜗毛细胞中的定位和功能可能在耳聋发病机制中扮演重要角色，突显了该基因在未来研究及临床应用中的潜力。
研究亮点
这一研究亮点包括：
1. 鉴定多个耳聋基因变异与HL的关联，促进了对遗传性听力损失的理解。
2. 展示了TOGARAM2基因作为耳聋候选基因的潜力。
3. 提供了支持TOGARAM2在耳蜗毛细胞中定位的新证据。
重要意义
该研究不仅在科学研究上提供了新的见解，助力了遗传性耳聋机制的探索，更为临床基因诊断和治疗提供了有价值的信息。这些发现有望推动个性化医疗的发展，提升遗传性听力损失的临床管理和咨询水平。