論文の概要

急性骨髄性白血病（AML）は成人において最も一般的な白血病の一種です。標準的な化学療法を受けた後、ほとんどのAML患者は完全寛解に至りますが、難治性および再発性の疾患は依然として大きな問題です。過去10年間で、免疫療法はがん治療において広く応用されており、特にキメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）療法は、血液悪性腫瘍、特にB細胞悪性腫瘍の治療において顕著な成功を収めています。しかし、CAR-T細胞療法はAMLにおいてその効果が限定的であり、その主な制限要因の一つがCAR-T細胞の「枯渇（exhaustion）」です。CAR-T細胞の枯渇は、その効果を維持し、持続的な臨床効果を達成するための核心的な課題となっています。

T細胞は体内で保護的な役割を果たし、認識した抗原を排除する役割を担っています。しかし、特定の状況下では、T細胞の機能は枯渇によって抑制されることがあります。T細胞の枯渇は、抗原への持続的な曝露、T細胞周囲の微小環境、および免疫抑制細胞などの要因によって引き起こされます。枯渇したT細胞は、PD-1、TIM-3、LAG-3、CTLA4などの抑制性受容体の発現増加、代謝異常、機能障害、および重要な転写因子遺伝子の変化を特徴とします。CAR-T細胞の枯渇も同様に、持続的な腫瘍抗原刺激と免疫抑制性の腫瘍微小環境によって引き起こされ、転写およびエピジェネティックな変化をもたらします。CAR-T細胞の枯渇はその機能に影響を与え、患者の予後にも関連しています。

T細胞の枯渇は多段階の進行性プロセスであり、著しい異質性を示します。異なる段階の枯渇T細胞は、異なるエピジェネティックおよび転写特性を示します。研究によると、枯渇したT細胞は、祖細胞枯渇、中間枯渇、終末枯渇、および増殖性枯渇のいくつかの異なる段階に分類されます。祖細胞枯渇のT細胞は、ナイーブおよびメモリーT細胞の特徴的な遺伝子発現レベルが高く、再プログラミングが容易であり、PD-1/PD-L1ブロック後も増殖を続けることができます。一方、終末枯渇のT細胞は、PD-1やTIM-3などの抑制性受容体の発現レベルが高く、再プログラミングが不可能であり、PD-1/PD-L1ブロック後に増殖能力を失います。

BETタンパク質ファミリー（BRD2、BRD3、BRD4、BRDTを含む）は、細胞の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その中でもBRD4は最も広く研究されているメンバーです。近年、BETタンパク質の機能不全、特にBRD4は、遺伝子変異や細胞の異常増殖を引き起こし、悪性腫瘍の発生につながることが明らかになっています。BETタンパク質を標的とした抗腫瘍薬は、臨床前研究および臨床試験において顕著な効果を示しています。JQ1は第一世代の合成BET阻害剤であり、血液悪性腫瘍に対する初期の臨床試験において、マウスモデルで顕著な抗腫瘍活性を示しました。最近の研究では、BET阻害剤が抗腫瘍免疫応答を改善することで悪性腫瘍の進行を抑制することが示されています。JQ1は、CD8+ T細胞のエフェクターメモリー細胞の表現型分化に関連する調節因子であるBATF（Basic Leucine Zipper ATF-like Transcription Factor）を直接阻害することで、中央メモリーT細胞（TCM）の特性を維持し、CD8+ T細胞の機能的な持続性を向上させることができます。

論文の出典

本論文は、Songnan Sui、Mengjun Zhongらによって2024年に『Biomarker Research』誌に掲載されました。著者らは、中国の暨南大学第一附属医院、暨南大学医学院血液学研究所などの機関に所属しています。論文では、単細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）技術を用いて、BRD4阻害剤JQ1がCAR-T細胞の枯渇をどのように減少させるかについてのメカニズムを探求しています。

研究のプロセス

1. CAR-T細胞枯渇モデルの構築：
   研究者らはまず、CAR-T細胞の枯渇モデルを構築しました。具体的には、CD123 CAR-T細胞と高発現CD123のMV411細胞を72時間共培養し、その後フローサイトメトリーを用いてCAR-T細胞表面の抑制性受容体（PD-1、TIM-3、LAG3など）の発現を検出し、CAR-T細胞が枯渇状態にあることを確認しました。枯渇したCAR-T細胞はその後、DMSO（対照群）と0.2 µM JQ1で72時間処理され、処理後のCAR-T細胞はフローサイトメトリーで分選され、単細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）および単細胞T細胞受容体シーケンス（scTCR-seq）が行われました。

2. 単細胞RNAシーケンスとT細胞受容体シーケンス：
   scRNA-seqおよびscTCR-seqライブラリは、10x Genomics Chromium単細胞5’キットを使用して構築され、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームでシーケンスが行われました。シーケンスデータは、CellRanger v6.1.2パイプラインを使用してヒトGRCh38参照ゲノムにマッピングされ、細胞ごとの遺伝子発現マトリックスが生成されました。その後、Seurat v4.3.0を使用して品質管理、フィルタリング、クラスタリング分析が行われました。

3. データ分析：
   研究者らは、Seurat v4.3.0を使用してscRNA-seqデータの正規化、次元削減、クラスタリング分析を行いました。Harmony v0.1.1パッケージを使用してバッチ効果を除去し、サンプルを統合しました。枯渇および増殖スコアは、scRNA-seqデータに基づいてSeurat v4.3.0パッケージのAddModuleScore関数を使用して計算されました。遺伝子セット機能エンリッチメント分析は、ClusterProfiler v4.2.2パッケージを使用して行われ、GOおよびKEGGエンリッチメント分析が含まれました。遺伝子調節ネットワーク分析は、pySCENIC v0.12.1を使用して行われ、遺伝子調節ネットワーク（GRN）が構築され、各調節子の活性が評価されました。

主な結果

1. JQ1がCAR-T細胞の枯渇を減少させる：
   対照群と比較して、JQ1処理されたCAR-T細胞では、枯渇したCD8+ CAR-T細胞の割合と枯渇スコアが有意に減少しました。さらに、JQ1処理により、ナイーブ、メモリー、および祖細胞枯渇のCD8+ CAR-T細胞の割合が増加し、終末枯渇のCD8+ CAR-T細胞の割合が減少しました。JQ1処理はまた、CAR-T細胞の増殖、分化、および活性化能力を向上させました。

2. JQ1がナイーブおよびメモリーCD8+ CAR-T細胞の機能を強化する：
   JQ1処理されたナイーブおよびメモリーCD8+ CAR-T細胞では、T細胞の増殖、活性化、および分化に関連する遺伝子の発現が有意にアップレギュレーションされました。転写調節ネットワーク分析では、JQ1処理されたナイーブCD8+ CAR-T細胞において、EGR1やBCLAF1などの転写因子の活性が増加し、POU2F2やZBTB38などの転写因子の活性が減少しました。

3. JQ1が早期枯渇のCD8+ CAR-T細胞の状態を維持する：
   JQ1処理により、祖細胞枯渇のCD8+ CAR-T細胞の割合が増加し、その終末枯渇状態への分化が阻止されました。機能エンリッチメント分析では、JQ1処理された祖細胞枯渇CD8+ CAR-T細胞において、T細胞の分化、活性化、および増殖に関連する遺伝子の発現がアップレギュレーションされました。

4. JQ1がBATFとEGR1を調節することでCAR-T細胞の枯渇を減少させる：
   JQ1処理されたナイーブ、メモリー、および祖細胞枯渇のCD8+ CAR-T細胞では、BATFの活性と発現がダウンレギュレーションされ、EGR1の活性と発現がアップレギュレーションされました。これらの転写因子の調節遺伝子は、T細胞の増殖、活性化、および分化に関連していました。

結論

本研究は、BRD4阻害剤JQ1がBATFの活性と発現をダウンレギュレーションし、EGR1の活性と発現をアップレギュレーションすることで、CAR-T細胞の枯渇を減少させ、その終末分化を阻止することを明らかにしました。これは、CAR-T細胞療法の有効性を改善するための新しい戦略を提供します。

研究のハイライト

1. 重要な発見：JQ1はBATFとEGR1の活性を調節することで、CAR-T細胞の枯渇を著しく減少させ、その機能を強化します。
2. 手法の革新：研究では初めて単細胞RNAシーケンス技術を使用し、JQ1がCAR-T細胞の枯渇をどのように調節するかを詳細に解析しました。
3. 応用価値：この研究は、AMLなどの血液悪性腫瘍におけるCAR-T細胞療法の応用に新しい視点を提供し、臨床的に重要な意義を持ちます。

その他の価値ある情報

研究ではまた、AML患者においてEGR1およびその標的遺伝子の高発現が良好な予後と関連し、BATFおよびその標的遺伝子の低発現も良好な予後と関連することが明らかになりました。これらの発見は、JQ1がBATFとEGR1を調節することでCAR-T細胞の機能を改善するメカニズムをさらに支持しています。