細胞および組織病理学的サンプルにおける核酸ターゲットの効率的で高度に増幅されたイメージング技術

2025-01-27 Mon
核酸イメージング信号増幅 in situハイブリダイゼーション蛍光顕微鏡組織病理学
組織および臨床研究における核酸標的信号の高効率拡増のための新プラットフォーム：PSABER研究の背景と関連知識1960年代にPardueとGallが初めて原位ハイブリダイゼーション（In Situ Hybridization, ISH）を提唱して以来、この技術は固定されたサンプルにおける核酸標的の空間的分布を視覚化する能力から、広く研究および臨床応用で注目を集めてきました。ISHは、標的RNAまたはDNAと相補的なプローブとのハイブリダイゼーション反応に基づいており、その結果は蛍光顕微鏡または透過光顕微鏡によって解析されます。ISH技術は、ゲノムDNAの位置決定、人間の核型解析、単一細胞RNAの定量解析、そして核内の染色体の空間的組織に関する研究に広く利用されています。その中でも、蛍光原位ハイブリダイゼーション（Fluorescent In Situ Hybridization, FISH）は、蛍光顕微鏡の多重標識能力を利用して、単一のサンプル上で複数のRNA転写物を可視化する点で特に重要です。
ISH技術は進化を続けているものの、信号感度の向上と適用範囲の拡大は依然として重要な課題です。特に、固定パラフィン包埋組織切片（FFPE）などの複雑なサンプルにおいては、信号増幅技術が重要な役割を果たします。既存の増幅技術は主に2つのカテゴリーに分かれます：組み立てベースの技術（例：分岐DNA信号増幅、ハイブリダイゼーションチェーンリアクション）および酵素ベースの技術（例：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase, HRP）による信号部位レポートの触媒）。しかしながら、これらの方法は操作が難しい、高コストである、または臨床技術と融合しにくいという欠点があることが一般的です。最近、KishiらはSABER（Signal Amplification by Exchange Reaction）技術を提案し、プローブを延伸した後、一本鎖DNAの連結結合部位をデザインする方法を発展させました。SABER技術は低コストで高感度ですが、その信号増幅能力には限界があり、色検出への対応も不十分です。
これに対して、研究チームはSABERを最適化した「PSABER」（Peroxidase SABER）を提案しました。この方法は、信号感度や広い適用性の不足を克服し、HRP酵素による蛍光または着色基質の局所的沈着を組み合わせることで信号を増幅させ、病理組織学の分野にその適用を拡大することを目的としています。
論文の情報と著者本研究は、Sahar Attar、Valentino E. Browning、Mary Krebsらの研究者が主導で行い、執筆者は主にアメリカのワシントン大学に所属する複数の研究機関から構成されています。これには、Department of Genome Sciences、Institute of Stem Cell and Regenerative MedicineおよびBrotman Baty Institute for Precision Medicineが含まれています。論文は2025年1月に『Nature Methods』（Volume 22, Issue 156–165）に掲載され、DOIは次の通りです：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02512-2。
PSABER研究内容の詳細実験設計と技術革新1. 実験ワークフローの概要PSABER研究の核心は、固定サンプル内でHRP結合オリゴヌクレオチドプローブを結合し、蛍光または着色基質の局所的沈着を触媒する連結検出部位を構築することです。研究フローは以下の主要なステップで成り立ちます：
プローブ延伸: 研究チームはプライマ交換反応（Primer Exchange Reaction, PER）を利用し、プローブを長く延伸させ、特定の繰り返し配列を含む長い連結形成オリゴヌクレオチド断片を形成します。
サンプルハイブリダイゼーション: 固定細胞やFFPEサンプルにおいて、目標DNA/RNAとまずプローブがハイブリダイゼーションします。
HRP信号増幅: ハイブリダイゼーションされたプローブにHRP標識されたオリゴヌクレオチドを結合させ、H2O2および顕色基質を導入することで蛍光または着色信号を触媒します。
信号増幅利用と多重検出: ソリューション交換（Solution Exchange）およびPSABERの拡張特性を活用して、高度な多重検出を実現します。
2. 方法の検証研究チームは以下のような核酸ターゲットに基づいて実験を行いました：
1. ADAMTS1 mRNAに対する原位RNAハイブリダイゼーション。
2. α衛星反復配列のゲノムスケールでのDNAハイブリダイゼーション。
3. 単一コピー200kbヒト染色体断片（Xp22.32領域）の検出。
4. FFPEヒト腎組織切片におけるUMOD RNAおよび47S前リボソームRNA配列の検出。
3. 溶液交換多重化研究チームは溶液交換技術を利用し、PSABERが分子標的の多回染色を可能にすることを確認しました。著者はPSABERを用いて固定細胞内でCBX5 RNA、7SK小核RNAおよび47S RNA配列の分布パターンを段階的に視覚化することに成功しました。
4. 光学システムの互換性実験は、PSABERが蛍光顕微鏡の使用に限らず、10倍または20倍のレンズといった低数値アパーチャ（Numerical Aperture）の光学システムでさえも明瞭に信号を分解できることを実証しました。
実験結果とSupporting Data本研究から得られた主な結果は次の通りです：
1. 信号増幅能力: 従来のFISHに比べ、PSABERはRNA検出において約25倍の信号増幅を提供しました。延伸反応および基質反応時間を延長することで、この増幅比率はさらに70倍に上昇しました。
2. 適用性の検証: 実験は多様なサンプル環境において、特定領域RNAの高感度検出を含むPSABERの堅牢性を確認しました。
3. 高解像多重化信号: データは、低コストの標準的光学機器を用いた場合でさえも、PSABER信号の空間分解能と解析信頼性が高いことを示しました。
研究の意義と科学的価値PSABER技術の広範な適用性は、基礎科学研究および臨床診断において顕著な重要性を示しています：
科学的価値: 固定組織サンプルにおける信号強度を大幅に向上させることで、PSABERは複雑な実験条件下におけるISHの欠点を効果的に補足しています。その低コスト優位性と多重検出能力により、リソース制約のある研究室や大規模臨床用途に最適です。
臨床的価値: FFPE組織サンプルの例では、PSABERはRNA/DNA標的の高感度で精密な位置決定を提供し、新たな技術選択肢を提示します。これにより、病因遺伝子の検出、がん診断および病理学の分野における応用が促進される可能性があります。
研究の主要なハイライト技術革新: PSABERは既存のSABER技術を基に、初めてカラー検出（色調法）対応を有効にしました。
高感度信号強調: 信号増幅が数倍から数十倍まで可能で、低感度機器にも対応します。
多重検出の可能性: ソリューション交換プロセスにより、多重目標染色を実現しました。
顕著なコスト効率: 高コストの市販ISH信号増幅手法と比較して、PSABERは経済的かつ効率的なソリューションを提供します。
PSABER技術は、核酸検出の信頼性を大幅に向上させ、固定サンプルにおけるISHアプローチの応用範囲を拡大します。この研究は、既存技術の空白を埋めるだけでなく、そのアクセス性、柔軟性および効率性により、分子生物学および病理診断分野に新たな応用方向を切り開きました。