Syntaxin 4 増強の細胞膜修復は骨格筋において Dysferlin に依存しない

背景紹介

細胞膜修復（Plasma Membrane Repair, PMR）は、細胞が膜の完全性を維持するための重要なプロセスであり、特に骨格筋などの主要な臓器における細胞死を防ぐ役割を果たします。Dysferlin は筋膜上に位置するカルシウム結合タンパク質で、骨格筋の細胞膜修復において重要な役割を果たすことが示されています。以前の研究では、細胞膜修復には膜輸送と膜融合が関与し、これは神経伝達におけるメカニズムと類似しています。可溶性 N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNAREs）は、神経伝達においてカルシウム結合タンパク質である Synaptotagmin の支援により膜融合を仲介します。興味深いことに、Dysferlin は Synaptotagmin と構造的に類似しており、リポソーム実験では SNARE 仲介の膜融合を促進することが示されています。しかし、Dysferlin が筋肉細胞における SNARE 仲介の細胞膜修復に関与しているかどうかは依然として不明です。

本研究では、薬理学的および遺伝学的な手法を使用して、筋肉細胞における SNARE 仲介の細胞膜修復が Dysferlin を必要とするかをテストすることを目指しました。研究では、Tat-NSF700 を使用して SNARE 複合体の解離を妨害し、SNARE の機能を阻害しました。その結果、Syntaxin 4（Stx4）による増強された細胞膜修復は骨格筋において Dysferlin に依存しないことが明らかとなり、細胞膜修復メカニズムに関する新しい視点を提供しました。

論文出典

本論文は Hsin-Yu Chen と Daniel E. Michele によって執筆され、両名とも米国ミシガン大学（University of Michigan）の分子統合生理学科および内科部門に所属しています。論文は 2025 年 1 月に『American Journal of Physiology - Cell Physiology』誌に掲載され、DOI は 10.1152/ajpcell.00507.2024 です。

研究フローと結果

1. Tat-NSF700 処理が機械的伸張誘発の膜損傷に及ぼす影響

研究フロー：
まず、Tat-NSF700 を用いて NSF（N-エチルマレイミド感受性因子）の ATP 酵素活性を抑制し、SNARE 複合体の解離を阻止することで、人間の誘導多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CMs）を処理しました。その後、これらの細胞に対して等軸機械的伸張を加え、膜損傷した細胞をヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide, PI）で標識しました。免疫蛍光染色により心筋細胞特異的なマーカーであるトロポニン I（TnI）と核染色剤 DAPI を標識し、PI 陽性細胞の割合を計算しました。

結果：
対照群と比較して、Tat-NSF700 処理を行った hiPSC-CMs は機械的伸張後に高い PI 陽性細胞の割合を示し、SNARE 複合体の機能障害が細胞膜の完全性を損なうことを示しました。

2. Tat-NSF700 処理がレーザー誘発の膜損傷に及ぼす影響

研究フロー：
さらに、マウス屈筋短筋（Flexor Digitorum Brevis, FDB）繊維上でレーザー誘発の膜損傷実験を行いました。FM1-43 染料を用いて膜損傷部位を標識し、カルシウムイメージング色素 Fluo-4 を用いて細胞内カルシウムレベルの変化をモニターしました。Tat-NSF700 処理後の FDB 繊維では、レーザー損傷後に FM1-43 の取り込みが減少し、カルシウム流入が増加しました。

結果：
FM1-43 の取り込みが減少したことは、Tat-NSF700 処理が SNARE 仲介のエンドサイトーシスを抑制した可能性を示唆し、一方でカルシウム流入の増加は、SNARE 複合体の機能障害が細胞膜修復効率を低下させることを示しました。

3. Stx4 および SNAP23 の過剰発現が細胞膜修復に及ぼす影響

研究フロー：
体内電気穿孔技術を用いて Stx4-mCitrine または EGFP-SNAP23 発現ベクターを FDB 繊維に導入しました。その後、レーザー損傷後のカルシウムレベルの変化をカルシウムイメージング色素 Rhod-2 を用いてモニターしました。

結果：
Stx4 または SNAP23 を過剰発現させた FDB 繊維は、レーザー損傷後に低いカルシウム流入を示し、Stx4 および SNAP23 の過剰発現が細胞膜修復を強化することを示しました。

4. Dysferlin 欠損型 FDB 繊維における Stx4 の過剰発現の効果

研究フロー：
Dysferlin 欠損マウスモデル（A/J マウス）を使用し、体内電気穿孔により Stx4-mCitrine 発現ベクターを FDB 繊維に導入し、レーザー損傷実験およびカルシウムイメージングを行いました。

結果：
Dysferlin 欠損の FDB 繊維でも、Stx4 の過剰発現によりレーザー損傷後のカルシウム流入が低下し、Dysferlin 欠損の骨格筋においても Stx4 による細胞膜修復が有効であることが示されました。

結論と意義

本研究は、SNARE 仲介の膜融合が骨格筋の細胞膜修復において重要な役割を果たすこと、そして Syntaxin 4 による細胞膜修復が Dysferlin 欠損の骨格筋においても有効であることを示しました。この発見は、細胞膜修復の分子メカニズムに対する理解を深め、Dysferlin 関連の筋疾患（例えば肢帯型筋ジストロフィー）の治療に新たなターゲットを提供します。

研究のハイライト

1. 細胞膜修復における SNARE 複合体の役割：SNARE 複合体の機能が骨格筋の細胞膜修復において重要な役割を果たすことを初めて実験的に証明しました。
2. Syntaxin 4 の独立した作用：Syntaxin 4 による細胞膜修復が Dysferlin 欠損の骨格筋においても有効であることが示され、SNARE 仲介の細胞膜修復が Dysferlin に依存しない可能性が示唆されました。
3. 新しい実験方法：Tat-NSF700 を用いた SNARE 複合体の解離阻害と、レーザー損傷およびカルシウムイメージング技術を組み合わせたことで、細胞膜修復を研究するための新しい実験手段を提供しました。

その他の有益な情報

本研究では、Synaptotagmin VII や Annexin A2 など他のカルシウム結合タンパク質が細胞膜修復において潜在的に果たす役割についても探討され、今後の研究方向が示されました。また、研究データは合理的な要請に基づき公開される予定で、他の研究者がさらなる分析を行う可能性が提供されています。

本研究を通じて、我々は骨格筋の細胞膜修復の分子メカニズムをより深く理解し、関連疾患の治療に新たなアプローチを提供しました。