反义寡核苷酸在仿人模型中增强SLC20A2表达并抑制脑钙化
反义寡核苷酸增强SLC20A2表达并抑制人源化小鼠模型中的脑钙化
背景与研究问题
原发性家族性脑钙化（Primary Familial Brain Calcification，PFBC）是一种与衰老相关的神经遗传性疾病，其特征是在基底神经节、丘脑、小脑等脑部区域出现双侧钙化沉积。PFBC患者常表现为头痛、帕金森样运动障碍、认知下降、焦虑和抑郁等多样症状。目前，对PFBC的临床管理仅依赖于对症治疗，尚无能有效抑制脑钙化进程的治疗方法。
已知PFBC的遗传学基础包括SLC20A2、PDGFRB、PDGFB等基因的突变，其中约61%的PFBC病例归因于SLC20A2基因的杂合性突变。然而，关于SLC20A2的突变如何导致脑钙化，其病理机制尚不完全清楚。本文的作者团队发现了SLC20A2基因的新型深内含子突变，并探讨了通过反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASOs）调控mRNA剪接来恢复基因表达的可能性。
来源与作者
这项研究由赵淼等人完成，主要作者分别来自福建医科大学、上海脑科学与类脑技术中心以及中国科学院神经科学研究所等多个机构。该研究发表于2024年10月9日的《Neuron》。
研究设计与流程
样本与遗传学分析
研究团队从135名经外显子测序无异常结果的PFBC患者中，通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）发现了6个家族的5种SLC20A2基因深内含子突变。这些突变通过Sanger测序验证，并通过计算预测分析揭示其可能影响mRNA的剪接位点。
分子机制研究
利用小基因（minigene）剪接模型，研究团队探讨了这些内含子突变如何导致异常剪接。结果显示，突变引入了新型的隐性外显子（Cryptic Exons），这些隐性外显子通过影响mRNA剪接增加了非功能性mRNA的生成，从而导致SLC20A2蛋白表达不足。
此外，通过RNA拉下（RNA Pull-down）和质谱分析，研究团队确认了特定RNA结合蛋白（如SRSF3和hnRNPQ）与隐性外显子结合能力的改变，进一步解释了突变如何干扰剪接调控机制。
细胞实验与ASO干预
研究团队设计了针对隐性外显子的ASOs，通过稳定结合RNA并阻止剪接体结合相关位点来抑制异常剪接。细胞实验结果显示，ASOs显著减少了隐性外显子介导的异常mRNA生成，并恢复了SLC20A2蛋白的表达水平。这一结果在PFBC患者衍生的成纤维细胞中得到了验证。
人源化小鼠模型验证
研究者创建了一个携带人类SLC20A2突变内含子序列的人源化敲入（Knock-in）小鼠模型，模拟PFBC患者的脑钙化病理过程。与野生型小鼠相比，敲入小鼠表现出脑脊液中无机磷（Pi）水平升高和进行性脑钙化沉积。
通过脑室内（Intracerebroventricular，ICV）注射ASOs，研究者成功降低了脑脊液Pi水平，并显著抑制了敲入小鼠的脑钙化进程，验证了ASO治疗的有效性。
主要发现与结果
- 遗传发现：首次明确了5种深内含子突变会引发SLC20A2基因隐性外显子介导的异常剪接，从而导致蛋白表达减少。
- 细胞水平验证：ASOs通过抑制隐性外显子剪接有效恢复了患者衍生细胞中SLC20A2蛋白的表达。
- 小鼠模型验证：在人源化小鼠中，ASO注射可降低脑脊液中的Pi水平，减缓脑钙化的进展。
- 治疗潜力：ASO介导的剪接校正技术为解决因SLC20A2不足导致的PFBC提供了一种可行的治疗策略。
研究意义与价值
科学价值
本研究系统揭示了深内含子突变通过隐性外显子导致基因功能丧失的分子机制，拓展了PFBC的遗传病因学。同时，研究还为SLC20A2基因相关疾病提供了新的小鼠模型，有助于深入探索其病理机制。
临床价值
ASO治疗在其他遗传性疾病中的成功应用（如脊髓性肌萎缩症和杜氏肌营养不良症）表明，ASO介导的剪接调控具有临床转化潜力。本文提出的“CRACE”策略（Calcification Repression by ASO Corrected Expression）不仅能有效减缓PFBC的钙化进程，还有望为其他与Pi稳态紊乱相关的疾病（如慢性肾病和心血管疾病）提供治疗思路。
亮点与创新
- 首次验证了SLC20A2深内含子突变的致病机制。
- 提出了基于ASO的“CRACE”治疗策略，为PFBC和其他遗传性疾病提供了新方向。
- 开发了一个高效模拟PFBC的敲入小鼠模型，便于进一步研究和药物筛选。
展望与改进方向
未来研究应进一步优化ASO的分子修饰和递送方式，以提高治疗的区域特异性和剂量效率。同时，将多种ASO组合用于治疗可能增强疗效，为实现精准医学奠定基础。
本研究的重要发现和技术创新展示了基因剪接调控在治疗遗传性疾病中的潜力，为开发新型疗法提供了坚实依据。