基于外周血单核细胞DNA甲基化的早期肺腺癌诊断新方法

背景介绍

肺腺癌（Lung Adenocarcinoma, LUAD）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，占肺癌病例的约40%。尽管近年来肺腺癌的治疗取得了显著进展，但其预后仍然不佳，主要原因之一是早期诊断的困难。大多数患者在首次就诊时已进入晚期，导致治疗效果不佳。目前，低剂量计算机断层扫描（Low-Dose Computed Tomography, LDCT）是早期肺腺癌筛查的常用工具，但其假阳性率高达96.4%，且现有的血清生物标志物（如CEA）在早期肺腺癌诊断中的敏感性和特异性较低。因此，开发一种非侵入性、高效的早期肺腺癌诊断方法具有重要意义。

DNA甲基化（DNA Methylation）是一种常见的表观遗传修饰，在基因表达的调控中起着关键作用。研究表明，癌症发生过程中存在全局性低甲基化和局部高甲基化的特征，尤其是在肿瘤抑制基因和癌基因中。外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是外周血中的单核细胞和淋巴细胞，作为免疫系统的重要组成部分，PBMCs在肿瘤发生过程中可能反映了免疫反应的变化，从而为基于免疫细胞分析的早期癌症诊断提供了理论基础。

论文来源

本论文由来自中国山东大学第二医院、齐鲁医院、广东省人民医院等多家机构的科研团队共同完成，主要作者包括Peilong Li、Shibiao Liu、Tiantian Wang等。论文于2024年9月30日在线发表在《International Journal of Surgery》期刊上，题为《Multisite DNA Methylation Alterations of Peripheral Blood Mononuclear Cells Serve as Novel Biomarkers for the Diagnosis of AIS/Stage I Lung Adenocarcinoma: A Multicenter Cohort Study》。

研究流程与结果

1. 研究设计与样本收集

本研究是一项多中心队列研究，共纳入了1115名参与者，分为四个队列：发现队列（Discovery Cohort）、两步DMP筛选队列（Two-Step DMP Screening Cohort）、LDP评分开发队列（LDP Score Development Cohort）和前瞻性队列（Prospective Cohort）。研究的主要目标是通过分析PBMCs中的DNA甲基化模式，开发一种用于早期肺腺癌诊断的新型生物标志物。

• 发现队列：包括35名肺腺癌患者和50名健康对照，使用Illumina 850K微阵列进行全基因组DNA甲基化分析，筛选出1415个差异甲基化位点（Differentially Methylated Positions, DMPs）。
• 两步DMP筛选队列：通过焦磷酸测序（Pyrosequencing）和多靶区甲基化富集测序（Multiple Target Region Methylation Enrichment Sequencing, MTRMES）验证候选DMPs，最终筛选出3个有效的DMPs。
• LDP评分开发队列：基于上述3个DMPs，结合年龄和性别，构建了早期肺腺癌诊断模型（LDP Score），并在训练集和验证集中进行了系统评估。
• 前瞻性队列：纳入46名肺癌高风险人群，评估LDP评分在肺腺癌早期预警中的应用价值。

2. 实验方法与数据分析

• PBMCs分离与DNA提取：使用Histopaque-1077分离PBMCs，并通过Tiangen凝胶提取试剂盒提取DNA，随后进行亚硫酸氢盐转化。
• Illumina 850K微阵列分析：对发现队列的样本进行全基因组DNA甲基化分析，使用R软件进行数据标准化和批次效应校正。
• 焦磷酸测序与MTRMES验证：通过焦磷酸测序和MTRMES技术验证候选DMPs的甲基化水平。
• 芯片数字PCR检测：开发了一种基于芯片的数字PCR方法，用于同时检测3个DMPs的甲基化状态，并构建LDP评分模型。

3. 主要结果

• 全基因组DNA甲基化分析：发现队列中，肺腺癌患者与健康对照之间存在1415个显著差异甲基化位点，其中1178个位点高甲基化，237个位点低甲基化。
• DMPs筛选与验证：通过严格的筛选标准，最终验证了3个DMPs（cg08194293、cg19197556、cg21634628），这些位点在肺腺癌早期阶段（AIS和I期）表现出显著的甲基化变化。
• LDP评分模型的构建与验证：LDP评分模型在训练集中的AUC为0.921，在验证集中的AUC为0.914，显著优于传统的CEA和CT检测方法。此外，LDP评分在6-20mm肺结节和磨玻璃结节（Ground-Glass Nodules, GGN）的诊断中也表现出色。
• 前瞻性队列结果：LDP评分能够在临床诊断前约2年预测肺腺癌的发生，显示出其在早期预警中的潜力。

4. 结论与意义

本研究开发了一种基于PBMCs DNA甲基化的新型早期肺腺癌诊断方法（LDP评分），具有高敏感性和特异性，显著优于现有的诊断工具。LDP评分不仅能够有效区分早期肺腺癌患者与健康对照，还能在高风险人群中提前预警肺腺癌的发生。这一研究成果为肺腺癌的早期诊断提供了新的思路和方法，具有重要的临床应用价值。

研究亮点

• 创新性：首次从PBMCs的DNA甲基化角度出发，开发了用于早期肺腺癌诊断的生物标志物。
• 高效性：LDP评分在早期肺腺癌诊断中的表现优于传统的CEA和CT检测方法，尤其是在6-20mm肺结节和GGN的诊断中。
• 前瞻性：LDP评分能够在临床诊断前约2年预测肺腺癌的发生，显示出其在早期预警中的潜力。

其他有价值的信息

本研究的基因组DNA甲基化数据已公开在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中，访问号为GSE275371。此外，研究团队还计划进一步优化LDP评分的检测时间和成本，以使其更符合临床需求。

通过这项研究，科研团队为肺腺癌的早期诊断提供了新的工具和方法，未来有望在临床实践中广泛应用，从而提高肺腺癌的早期发现率和治疗效果。