新型内吞抑制剂阻断HIV-1 Tat蛋白进入神经细胞

学术背景

HIV-1（人类免疫缺陷病毒1型）感染不仅导致免疫系统衰竭，还与神经认知障碍（HIV-associated neurocognitive disorders, HAND）密切相关。尽管抗逆转录病毒治疗（combined antiretroviral therapy, cART）显著改善了HIV感染者的生存率，但HIV-1仍在感染者体内持续存在，并导致约三分之一的患者出现神经认知障碍。HIV-1的神经毒性主要与其病毒蛋白Tat（transactivation of transcription protein）有关。Tat蛋白能够穿过血脑屏障，进入神经细胞，引发氧化应激、DNA损伤和线粒体功能障碍，最终导致神经元死亡。

内吞作用（endocytosis）是病毒进入细胞的主要途径之一，HIV-1 Tat蛋白也通过内吞作用进入细胞。因此，阻断Tat蛋白的内吞过程可能是防止其神经毒性的有效策略。然而，现有的内吞抑制剂存在非特异性效应和副作用，限制了其临床应用。为了解决这一问题，本研究旨在开发新型内吞抑制剂，评估其对Tat蛋白内吞的阻断效果，并探讨其在神经保护中的潜在应用。

论文来源

本论文由来自波兰、法国和乌克兰的多家研究机构的科研团队共同完成。主要作者包括Olga Klaudia Szewczyk-Roszczenko、Piotr Roszczenko、Anna Shmakova等人，他们分别来自Medical University of Białystok、Institut Gustave Roussy、Danylo Halytsky Lviv National Medical University等机构。论文于2024年12月24日首次发表在《American Journal of Physiology-Cell Physiology》期刊上，DOI为10.1152/ajpcell.00723.2024。

研究流程

1. 内吞抑制剂的设计与合成

研究人员设计并合成了两种新型内吞抑制剂LES-6631和LES-6633。这两种化合物基于rhodanine（罗丹宁）骨架，通过Knoevenagel缩合反应合成了目标化合物。为了提高其水溶性，研究人员进一步将其转化为甲磺酸盐形式。合成过程中使用了核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术对化合物进行了表征。

2. 细胞培养与分化

研究使用了人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为模型细胞。为了模拟神经元的分化状态，研究人员将SH-SY5Y细胞在含有视黄酸（retinoic acid）和B-27补充剂的培养基中培养了10天。细胞分化状态通过Ki-67抗体和鬼笔环肽（phalloidin）染色进行评估。

3. 细胞毒性评估

为了评估LES-6631和LES-6633的细胞毒性，研究人员在多种细胞系（包括乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7，神经母细胞瘤SH-SY5Y等）中进行了MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）实验。结果表明，这两种化合物在测试浓度下表现出较低的细胞毒性，IC50值均高于30 μM。

4. 内吞抑制实验

研究人员通过荧光标记的葡聚糖（dextran）和Tat-Cy5复合物评估了LES-6631和LES-6633对内吞作用的抑制效果。细胞在预处理1小时后，加入荧光标记的Tat-Cy5或葡聚糖，随后进行固定和显微镜观察。结果显示，LES-6631和LES-6633在低浓度下能够显著抑制内吞作用，效果优于经典的内吞抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine）。

5. 氧化应激与DNA损伤评估

为了研究LES-6631和LES-6633对Tat蛋白诱导的氧化应激和DNA损伤的保护作用，研究人员进行了活性氧（ROS）检测和碱性彗星实验（alkaline comet assay）。结果显示，预处理这两种化合物能够显著降低Tat蛋白诱导的氧化应激和DNA损伤。

6. 谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）水平检测

研究人员还评估了LES-6631和LES-6633对细胞内谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）水平的影响。结果显示，这两种化合物能够显著提高细胞内GSH水平，并降低NO的产生，表明它们在减轻Tat蛋白诱导的氧化应激和氮化物应激方面具有显著效果。

主要结果

1. 内吞抑制效果：LES-6631和LES-6633在低浓度下能够显著抑制Tat-Cy5和葡聚糖的内吞作用，效果优于氯丙嗪。
2. 氧化应激保护：这两种化合物能够显著降低Tat蛋白诱导的氧化应激，使细胞内的ROS水平恢复到正常水平。
3. DNA损伤保护：通过彗星实验，研究人员发现LES-6631和LES-6633能够显著减少Tat蛋白诱导的DNA断裂。
4. GSH和NO水平调节：这两种化合物能够显著提高细胞内GSH水平，并降低NO的产生，表明它们在减轻氧化应激和氮化物应激方面具有显著效果。

结论与意义

本研究成功开发了两种新型内吞抑制剂LES-6631和LES-6633，它们在低浓度下能够有效阻断HIV-1 Tat蛋白的内吞过程，并显著减轻Tat蛋白诱导的氧化应激、DNA损伤和氮化物应激。这些化合物具有较低的细胞毒性，且在神经保护方面表现出显著效果，表明它们在治疗HIV相关的神经退行性疾病中具有潜在的应用价值。

研究亮点

1. 新型内吞抑制剂：LES-6631和LES-6633是基于rhodanine骨架的新型化合物，具有高效的内吞抑制作用。
2. 多效性保护作用：这两种化合物不仅能够阻断Tat蛋白的内吞，还能够减轻氧化应激、DNA损伤和氮化物应激，具有多重保护作用。
3. 低细胞毒性：在多种细胞系中，LES-6631和LES-6633表现出较低的细胞毒性，表明其具有良好的安全性。
4. 潜在临床应用：这些化合物在神经保护中的显著效果为其在HIV相关神经退行性疾病治疗中的应用提供了理论依据。

其他有价值的信息

本研究的实验数据已通过合理请求提供，相关补充材料可通过DOI 10.5281/zenodo.14287922获取。研究得到了Medical University of Białystok、National Research Foundation of Ukraine等机构的资助。