转录组学技术跟踪序列(Tracking-Seq)揭示CRISPR-Cas9介导的基因组编辑的脱靶效应异质性

研究背景

随着基因组编辑技术的飞速发展，CRISPR-Cas9系统因其高效率、易操作而被广泛应用于生物医学研究领域。然而，由于CRISPR-Cas9系统进行DNA编辑时可能产生非靶效应，即在意图编辑以外的基因位点发生切割，因此如何对非靶效应进行全面识别和评估已成为科研中的一项重要课题。之前的研究主要采用细胞游离法等方法检测非靶效应，但这些方法往往存在对特定编辑工具或细胞类型的依赖性、需要大量细胞、假阳性率高以及仅限于体外基因组编辑等局限。鉴于此，开发一种通用的、能够在细胞原位直接检测非靶效应的方法显得十分迫切。另一方面，目前的研究也有所忽视编辑工具的靶向异质性，即不同编辑工具在不同细胞类型之间的非靶效应可能存在差异，这对于临床治疗尤其关键。因此，新的技术平台不仅要能够适用于检测各种编辑工具的非靶效应，还应能够兼容不同细胞类型，以适应各种研究和应用场景。

论文来源

本项研究由Ming Zhu、Runda Xu、Junsong Yuan等人共同完成，隶属于清华大学生命科学学院Tsinghua-Peking Joint Center for Life Sciences、医学院基础医学科、生物信息学教育部重点实验室、IDG/McGovern Institute for Brain Research、系统合成生物学中心、清华大学药学院、生命学院、北京市分子肿瘤联合实验室等多个科研院所。该篇论文于2024年发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

研究详情

操作流程

研究共涉及四个主要步骤：

a) 利用Cut&Run技术捕获RPA结合的单链DNA(ssDNA)。 b) 运用HL-dsDNase特异性移除双链DNA(dsDNA)，丰富ssDNA。 c) 构建特异性ssDNA文库。 d) 下一代测序(NGS)和用Offtracker软件进行生物信息学分析。

研究结果

通过对编辑后细胞的测序分析，研究团队展示了Tracking-Seq有效捕捉RPA绑定的ssDNA。即使在低细胞投入率下，仍能成功检测到靶点和非靶点位点的编辑活动。时间序列分析显示不同编辑工具的Tracking-Seq信号动态各异。

研究结论

研究提出的Tracking-Seq技术展示出高敏感性和实用性，能够广泛应用于许多常见基因组编辑工具，不仅适用于体外实验，还可用于体外和体内基因组编辑场景。

研究亮点

Tracking-Seq技术不仅能够实现低细胞投入的非靶效应直接检测，还能揭示同一向导RNA在不同编辑模式和不同细胞类型中的非靶效应异质性。这些发现强调了原位测量原始系统中非靶效应的必要性。

其他信息

本研究还研发了相应的算法用于数据分析，同时提出了针对不同编辑工具渐进增强或减弱非靶效应的双向变化趋势。此外，研究发现不同细胞类型中的编辑效率存在异质性，提示在替代细胞系中评估非靶效应可能不够可靠，对于体外或体内应用可能存在风险。

结论

这项研究不仅为CRISPR-Cas9及其他基因组编辑工具的非靶效应检测提供了有效技术，还为科研工作者在高风险临床应用前进行全面风险评估提供了重要依据，助力基因编辑技术向临床应用的平稳过渡。