单细胞转录组分析揭示CCR5过表达的间充质干细胞对自身免疫性葡萄膜炎的保护作用

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CCR5过表达间充质干细胞对实验性自身免疫性葡萄膜炎的保护作用

背景介绍

葡萄膜炎是一种严重威胁视力的眼部炎症性疾病，可能导致白内障、青光眼、玻璃体混浊、视网膜脱离和视网膜血管异常等后遗症。这种疾病在全球范围内广泛存在，其中一种形式是自身免疫性葡萄膜炎（Autoimmune Uveitis，简称AU），在人类中是工业化国家中第四大导致严重视力损失的原因。这类疾病通过多种病理机制发挥作用，并在不同疾病中表现出多种特征。

为进一步了解葡萄膜炎的发病机制，研究人员一直以来采用实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis，简称EAU）动物模型来研究这种疾病。1988年起，研究者通过视间光受体类视黄醇结合蛋白（Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein, IRBP）诱导EAU，这个模型与人类葡萄膜炎有许多病理相似性，并被广泛用于研究遗传影响、揭示致病机制和测试潜在的治疗方案。然而，无论是EAU还是其他动物模型，都无法完全再现人类葡萄膜炎的全部特点。

研究来源

该研究论文发表在《Journal of Neuroinflammation》期刊上，题为“CCR5-overexpressing mesenchymal stem cells protect against experimental autoimmune uveitis: insights from single-cell transcriptome analysis”，由Yuan等人于2024年撰写，作者主要来自中山大学中山眼科中心和中山医学院。

研究内容

研究流程

本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和整体RNA测序（RNA-seq）技术，结合多种分子和细胞方法，对小鼠经典EAU模型进行了详细的研究。研究流程包括以下几个步骤：

  1. EAU小鼠模型建立：

    • 利用人IRBP第651-670位肽段免疫C57BL/6小鼠，随后进行免疫抑制15天，以确保葡萄膜炎的成功诱导。
    • 通过眼底成像、荧光眼底血管造影（FFA）和光学相干断层成像（OCT）对小鼠进行病情评估。

  2. 单细胞转录组分析：

    • 在疾病诱导的14天后，采集视网膜组织进行单细胞转录组测序（scRNA-seq）。采用10x Genomics平台，获取20448个单细胞的转录组数据。
    • 对不同细胞类型进行聚类分析，并确定视网膜中主要的细胞群，包括微胶质细胞、单核细胞/巨噬细胞、T/NK细胞、各种视网膜神经细胞和血管内皮细胞。

  3. 整体转录组分析：

    • 使用RNA-seq技术，对视网膜进行整体基因表达分析。通过基因本体论（GO）和基因集富集分析（GSEA）评估基因表达的变化。

  4. Müller Glia作用研究：

    • 发现Müller细胞在EAU过程中可能作为抗原呈递细胞（APCs）发挥作用。
    • 对Müller细胞进一步聚类分析，揭示其不同亚群的基因表达谱。

  5. 免疫细胞侵润分析：

    • 深入分析了EAU小鼠视网膜中的免疫细胞，包括多种T细胞亚型的侵润情况，以及细胞间信号传导分析。

  6. CCR5过表达MSC的迁移及疗效测试：

    • 实现了人CCR5过表达的间充质干细胞（MSC）的制备，评估其在体外和体内对CCL5的趋化能力。
    • 将MSC移植至EAU小鼠，评估其治疗效果，特别是对M1型微胶质细胞活化、T细胞和巨噬细胞侵润的影响。

研究结果

  1. 多种免疫细胞侵润至EAU小鼠视网膜：

    • 眼底成像显示，随着疾病进展，小鼠视网膜显示出显著的血管漏出、视网膜结构紊乱和大量CD45阳性白细胞及CD11b阳性髓系细胞侵入。

  2. 视网膜神经细胞的减少：

    • 单细胞转录组分析揭示了视网膜神经细胞数量的显著减少，具体表现为双极细胞、锥细胞和水平细胞减少。
    • 整体转录组分析显示，EAU视网膜中所有神经细胞类型的标记基因表达下调。

  3. Müller Glia的活化及抗原呈递功能：

    • 发现EAU过程中Müller细胞表达主要组织相容性复合体II类（MHC II）基因，并呈现MHC II蛋白表达，提示Müller细胞可能作为非专业抗原呈递细胞。

  4. 视网膜中T细胞的多样性：

    • 视网膜中浸润的T细胞以Th1细胞为主，占所有免疫细胞的19.83%。

  5. CCL5表达显著上调：

    • EAU视网膜中的CCL5基因表达最为显著，表达量达对照组的2500倍。

  6. CCR5过表达MSC的迁移及疗效：

    • 体外试验证实CCR5过表达MSC在CCL5的驱动下，表现出显著的趋化能力。
    • 体内实验表明，移植CCR5过表达MSC的小鼠视网膜中，极显著减少了活化的微胶质细胞和浸润的T细胞及巨噬细胞数目。此外，与对照组相比，移植组显示出更轻的视网膜结构损伤及炎症评分更低。

  7. NLRP3炎性体相关基因的下调：

    • MSC治疗组视网膜中的NLRP3和IL-1β的表达显著下调。

研究结论

本研究揭示了EAU对视网膜细胞的广泛破坏，揭示了Müller细胞在EAU中的潜在抗原呈递功能，并发现Th1细胞是主要的侵润细胞类型。通过CCL5在视网膜中的明显上调，该研究提出并验证了通过移植CCR5过表达MSC治疗EAU的策略，显著提高了MSC的趋化能力和治疗效果。这为MSC治疗EAU提供了新的思路，具有潜在的临床应用前景。

研究的亮点

  • 创新的单细胞转录组分析技术：首次使用scRNA-seq技术全面解析IRBP诱导的经典EAU模型。
  • CCR5过表达MSC的实验验证：CCR5过表达显著提高了MSC在视网膜中的迁徙能力和治疗效果，这一创新策略可能拓展了MSC在治疗自身免疫疾病中的应用前景。
  • 视网膜免疫环境的深入解析：揭示了视网膜细胞类型和免疫细胞的复杂变化，为理解EAU的发病机制提供了重要的数据支持。

材料与方法

研究所用小鼠在符合伦理标准的条件下养殖，使用C57BL/6小鼠进行EAU模型诱导，并采用各种成像及分子生物学技术进行检测和分析。此外，研究中利用fx性蛋白质组数据分析、实时定量PCR等方法，验证了迁移能力及炎性体表达等实验结果。

讨论

本研究通过使用单细胞转录组和整体转录组测序技术，详细解析了EAU模型视网膜的细胞组成和基因表达变化。进一步探讨了Müller细胞在活化状态下可能的抗原呈递功能，并通过CCR5过表达的MSC移植实验，展示了这一策略在改善EAU临床表现方面的显著效果。

未来的研究可以进一步优化MSC移植的具体方法，如修饰MSC的方法、移植的最佳时间点、注射细胞的数量以及移植的频率等，从而为临床应用提供更全面的依据。