4-1BB编码的CAR通过截留A20泛素修饰酶引起细胞死亡
背景介绍
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）在某些血液恶性肿瘤中的免疫治疗已显示出巨大的潜力。然而，CAR分子中包含的CD28和4-1BB共刺激内域如何在CAR-T细胞中起作用，仍未得到全面了解。CD28和4-1BB内域在CAR-T细胞中均表现出显著不同的磷酸化模式，这可能部分解释了为什么CD28共刺激介导的CAR-T细胞能够更快地杀死肿瘤，而4-1BB介导的效果相对较慢。此外，4-1BB共刺激的CAR-T细胞通常与更好的T细胞持久性、代谢适应性和记忆形成有关，但其增加了T细胞凋亡的风险。探究CD28和4-1BB内域在CAR-T细胞中的分子相互作用，对于优化CAR-T细胞的设计至关重要。
论文来源
本研究由Zhangqi Dou等研究人员完成，研究人员来自北卡罗来纳大学教堂山分校的Lineberger综合癌症中心、第二附属医院浙江大学医学院神经外科以及其他多个部门。论文于2024年6月27日在线发表于《Cellular & Molecular Immunology》杂志。
研究详情
研究流程
研究人员首先构建了特异性识别CD19抗原的CAR，分别包含CD28（19.cd28ζ）和4-1BB（19.bbζ）内域，通过伽马逆转录病毒基因转移表达在激活的人T细胞中。研究表明，19.bbζ CAR-T细胞在培养过程中形成了大的细胞聚集体，并显示出较多阳性Annexin-V标记细胞，这与细胞死亡（凋亡和坏死性凋亡）的增加有关。
为了探讨这些观察结果是否由CAR-T细胞的自我聚集引起的，研究人员使用共聚焦显微镜进行观察，发现19.cd28ζ和19.bbζ CAR-T细胞在细胞表面具有相似的分布。此外，不同抗体的CAR在细胞聚集和Annexin-V表达方面显示出相似的结果。
研究进一步通过遗传操作，如过表达或删除4-1BB的TRAF结合结构域，来探讨A20的角色。研究表明，去除4-1BB的TRAF结合结构域可以减少细胞聚集和细胞死亡，提高4-1BB共刺激的CAR-T细胞的抗肿瘤能力。
主要结果
4-1BB信号引起CAR-T细胞聚集和细胞死亡：与19.cd28ζ CAR-T细胞相比，19.bbζ CAR-T细胞形形成更大的细胞聚集体和更高的Annexin-V阳性细胞比例。
4-1BB共刺激诱导细胞凋亡和坏死性凋亡：在培养过程中，19.bbζ CAR-T细胞显示出较高的早期和晚期凋亡细胞比例，以及增加的RIPK1磷酸化和RIPK3磷酸化，表明存在坏死性凋亡。
NF-κB信号通路的激活：19.bbζ CAR-T细胞表现出NF-κB信号通路的高活性，具体表现为IKKα/β和P65的磷酸化增加，以及ICAM-1的过表达。NF-κB信号通路的过度激活导致细胞聚集和细胞死亡。
A20的作用：A20作为NF-κB通路的关键负调控因子，在19.bbζ CAR-T细胞中表现出异常的定位和功能缺失。通过过表达A20能够减少细胞死亡和细胞聚集，并恢复CAR-T细胞的扩增能力。
免疫沉淀和质谱分析：质谱分析显示，TRAF2/3在19.bbζ CAR中更为丰富，而A20几乎仅在19.bbζ CAR下被捕获，进一步说明A20在4-1BB共刺激中发挥着重要作用。
研究结论
该研究表明，4-1BB共刺激内域在CAR-T细胞中引发的细胞聚集和细胞死亡与NF-κB/A20信号通路密切相关。通过过表达A20或删除4-1BB的TRAF结合序列，可以有效减少细胞聚集和细胞死亡，从而提高CAR-T细胞的抗肿瘤效力。
研究亮点
揭示了4-1BB共刺激在CAR-T细胞中引发细胞聚集和死亡的机制：研究表明4-1BB共刺激通过TRAF介导的A20功能缺失，导致了NF-κB信号通路的过度激活并引发细胞凋亡和坏死性凋亡。
提出了改善CAR-T细胞设计的新策略：通过删除4-1BB的TRAF结合结构域或过表达A20，可以显著提高4-1BB共刺激的CAR-T细胞的抗肿瘤能力。
为未来的CAR-T细胞治疗提供了新的思路：研究结果有助于优化CAR-T细胞的设计，提高其治疗效果并减少副作用。
研究价值
本研究为4-1BB共刺激的分子机制提供了新的见解，并提出了通过调节A20来优化CAR-T细胞的设计，提高其抗肿瘤效力的新策略。这些发现不仅具有重要的科学价值，而且为CAR-T细胞在临床上的应用提供了新的思路，具有显著的应用价值。
备注
- 研究中涉及的所有实验方法和材料，包括细胞系、质粒构建、流式细胞术、共聚焦显微镜成像、细胞共培养实验、免疫沉淀、质谱分析、定量PCR、NF-κB报告基因检测、CAR-T细胞增殖实验和RNA测序，均详细描述在原文中。
- 相关数据和结果的具体统计分析方法和结果在报告中均有详细描述。