TPN10475通过促进TGF-β信号传导抑制效应T淋巴细胞激活并减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的病情

引言

多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是一种由免疫细胞介导的中枢神经系统（central nervous system, CNS）炎性脱髓鞘疾病，具有复杂的病因和不明确的发病机制。MS以年轻人中的神经功能障碍为特征，是一种非创伤性致残性疾病，其流行率在全球范围内不断增加。尽管现有治疗MS的药物已经在一定程度上对其病情有所控制，但其副作用和药物相关的严重不良事件仍是重大的医疗挑战。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）常被用作MS的动物模型，用于研究疾病的发病机制和潜在的治疗方法。EAE的病理学和组织学与MS高度相似，主要表现为中枢神经系统中的异常炎性细胞浸润，导致神经轴突的脱髓鞘。

在MS的发病过程中，CD4+ T细胞是关键的参与者，尤其是Th1和Th17细胞，这些细胞通过产生炎性因子和细胞因子破坏脊髓和轴突，并吸引更多的炎性细胞进一步加剧炎症反应。此外，CD4+ T细胞也能通过特定的CD4+ T调节细胞（Treg）和其他调节反馈机制来抑制效应CD4+ T细胞功能，从而下调炎症。

转化生长因子β（Transforming Growth Factor Beta, TGF-β）是一类控制细胞增殖、分化和转移的重要细胞间信号，其通过细胞膜表面受体复合物介导信号传导，最终调控靶基因的表达。研究表明，TGF-β在免疫调节中发挥重要作用，其中包括抑制免疫细胞的增殖、分化和活化。

青蒿素及其衍生物不仅以其抗疟疾作用而闻名，近年来也展现出强大的免疫抑制活动，在MS和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中表现出显著的治疗效果。青蒿素衍生物TPN10466在小鼠EAE疾病中可通过增强Treg细胞的扩增和功能来发挥保护作用。

本研究聚焦于一种新的青蒿素衍生物TPN10475，旨在探讨其对EAE病情的缓解作用及其可能的机制。研究结果表明，TPN10475能有效抵抗TCR信号刺激诱导的TGF-β信号传导的减少，抑制效应CD4+ T细胞的活化功能，并限制病理性Th1和Th17细胞的分化。而且，TPN10475通过减少外周自反应辅助T淋巴细胞的活化驱动和抑制炎性细胞向中枢神经系统迁移，减轻了EAE的病情。

材料与方法

研究所使用的小鼠为6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠，均购自Gempharmatech，饲养在同济大学动物护理设施中，所有动物实验程序均经同济大学动物研究伦理委员会批准。

CD4+ T细胞的分离与体外极化

采用磁性细胞分选技术从小鼠脾细胞中纯化CD4+ T细胞，然后用抗小鼠CD3和抗小鼠CD28抗体激活细胞并在包含不同细胞因子的RPMI 1640培养基中极化细胞。

细胞增殖与活力检测

使用羧基荧光二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料跟踪淋巴细胞的细胞分裂，并利用Cell Counting Kit-8（CCK8）解决方案评估HEK293T细胞的生长情况。

流式细胞术分析

通过流式细胞术分析体外和体内实验中的细胞表面标志物和细胞因子表达，检测细胞活性和凋亡。

定量实时PCR

提取CD4+ T细胞的总RNA，逆转录为cDNA，并通过定量实时PCR检测特定基因的表达。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

采用商业化ELISA试剂盒检测细胞培养上清液和小鼠血清中的炎性细胞因子和抗炎细胞因子的浓度。

EAE的诱导与评估

通过向小鼠皮下免疫注射MOG35-55肽诱导EAE，评估小鼠的体重变化和临床评分，并采用病理学分析评估脊髓的炎性细胞浸润和白质脱髓鞘情况。

RNA测序分析

提取CD4+ T细胞的总RNA，进行RNA-seq分析以筛选出差异表达基因，并进行热图、火山图、KEGG通路分析和基因本体论（GO）分析。

统计分析

实验数据以平均值±标准误表示，采用未配对双尾Student’s t检验或Mann-Whitney U检验进行统计分析，统计显著性以P < 0.05为准。

结果

TPN10475抑制CD4+ T细胞的增殖和效应功能

体外实验证明，TPN10475显著抑制了抗CD3/CD28活化诱导的效应记忆CD4+ T细胞的生成，进一步分析表明，其对效应记忆CD4+ T细胞分泌的IFN-γ和TNF-α也有明显的抑制作用。这表明TPN10475具有抑制效应记忆CD4+ T细胞功能的作用。

TPN10475限制Th1和Th17细胞的发育

进一步研究发现，TPN10475能够剂量依赖性地抑制Th1和Th17细胞的生成，而对Treg细胞则略有促进作用。TPN10475还抑制了Th1细胞分泌IFN-γ和TNF-α，以及Th17细胞分泌IL-17A和GM-CSF的能力。

TPN10475减轻EAE小鼠的临床症状

通过给EAE小鼠口服不同剂量的TPN10475，结果表明，TPN10475不仅减轻了EAE小鼠的临床症状，还延缓了疾病的发作时间。病理学分析显示，TPN10475显著减少了脊髓的炎性细胞浸润和白质脱髓鞘面积。

TPN10475抑制CNS中的炎症反应

流式细胞术分析表明，TPN10475处理组的小鼠CNS中浸润的CD4+ T细胞比例显著降低，尤其是Th17和Th1样Th17细胞亚群的比例显著减少。这表明TPN10475能够减少CNS中的炎症细胞浸润。

TPN10475抑制EAE早期的炎症激发

研究发现，治疗组小鼠在疾病早期外周血清中炎性细胞因子的分泌显著减少，说明TPN10475在EAE发病早期就能产生明显的抑制炎症作用。

TPN10475调节EAE发病初期的外周组织免疫反应

流式细胞术分析显示，TPN10475显著降低了EAE小鼠脾脏和外周淋巴结中CD4+ T细胞的比例，同时显著减少了Th1、Th17和Th1样Th17细胞比例，促进了Treg细胞的生成。此外，TPN10475显著降低了外周免疫细胞分泌的炎症细胞因子水平，进一步验证了其免疫调节作用。

TPN10475通过增强TGF-β受体信号通路抑制效应CD4+ T细胞的激活

RNA测序分析显示，TPN10475显著影响了TGF-β受体信号通路和炎症反应的负调控，提升了TGF-β受体信号通路相关基因的表达水平。实验结果进一步证实，TPN10475通过促进TGF-β信号通路抑制了效应CD4+ T细胞的激活，并限制了Th1和Th17细胞的分化。

抑制TGF-β信号逆转TPN10475对激活CD4+ T细胞的影响

通过使用TGF-β受体抑制剂LY2109761干预CD4+ T细胞，发现阻断TGF-β信号能够逆转TPN10475对激活CD4+ T细胞的抑制作用，这进一步验证了TPN10475通过促进TGF-β信号通路抑制效应CD4+ T细胞激活的机制。

结论

本研究发现，青蒿素衍生物TPN10475通过促进TGF-β信号传导，显著抑制了效应CD4+ T细胞的增殖和激活，限制了病理性Th1和Th17细胞的分化，并通过减少外周自反应辅助T淋巴细胞的活化驱动和炎性细胞向中枢神经系统迁移，减轻了EAE的病情。这一研究为进一步研究自身免疫性疾病的治疗提供了宝贵的参考，也为调控TGF-β信号通路以缓解EAE提供了潜在的基础。