AIFM1基因错义变异导致线粒体功能障碍与核黄素缺乏不耐受

研究背景

线粒体是具双膜结构的细胞器，存在于有核真核细胞中，主要通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）来提供细胞能量。线粒体拥有自己的基因组，编码着参与线粒体呼吸链复合物的13种蛋白质，其他线粒体蛋白则由核基因组编码并被导入到线粒体。其中，凋亡诱导因子（Apoptosis-Inducing Factor, AIFM1）是一种由X连锁AIFM1基因编码的线粒体黄素蛋白，参与无胱天蛋白酶的细胞死亡，并调控呼吸链复合物的生物合成。

研究表明，AIFM1基因的突变与多种临床表型相关，但核黄素（即维生素B2）治疗的效果仍存在争议。本研究旨在探索AIFM1基因c.1019T > C变异导致线粒体功能障碍的机制，并评估核黄素补充对该变异的影响。

研究来源

该研究由山东大学齐鲁医院神经肌肉和神经退行性疾病研究所、山东大学齐鲁医院（青岛）线粒体医学实验室、山东大学脑科学研究所、山东中医药大学附属医院等单位的研究人员共同完成，主要作者包括Zhao Ying、Lin Yan、Wang Bin、Liu Fuchen等。研究成果于2023年5月23日收到，经2023年8月9日接受，并于2023年8月21日在线发表在《Neuromolecular Medicine》上。

研究方法和流程

实验对象

研究对象为一名7岁男孩，因步态异常住院，临床表现为小脑共济失调、轴索感觉运动神经病变和肌肉无力，其家族史无显著异常。经过伦理委员会批准后，研究对男孩及其父母进行了全基因组DNA测序和组织学分析。

基因组和氨基酸分析

从外周血中提取总基因组DNA，并通过下一代测序（NGS）进行神经疾病基因组检测，使用Sanger测序确认变异并进行家族验证。氨基酸保守性分析使用MutationTaster完成。

肌肉组织学和免疫组织化学研究

对患者进行二头肌活检，并对8μm厚的冷冻切片进行一系列组织化学和免疫组织化学染色，包括苏木精-伊红染色（HE）、改良Gomori三色染色（MGT）、细胞色素C氧化酶（COX）染色等。此外，对肌肉切片进行AIFM1抗体（17984-1-AP, Proteintech）的免疫组织化学染色。

成纤维细胞培养

从皮肤活检中获取原代皮肤成纤维细胞，并根据标准方法进行培养。成纤维细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。进行核黄素缺乏研究时，使用不含核黄素的定制DMEM培养基。对核黄素补充研究，加入等量不同浓度的核黄素溶液。

Western Blotting

对肌肉样本和皮肤成纤维细胞进行裂解，并进行蛋白定量。每个样本加载30μg蛋白质，在12%变性SDS-PAGE中电泳，之后转移至PVDF膜，分别使用针对AIFM1、全氧磷抗体鸡尾（OXPHOS Antibody Cocktail）和其他线粒体呼吸链复合物亚单位的主要抗体进行印迹分析。

氧气消耗率测量

用Seahorse Bioscience XFe24分析仪测量成纤维细胞的氧气消耗率，并在加入不同的抑制剂和解耦合剂后，测量ATP生成、最大呼吸和非线粒体呼吸等。

线粒体膜电位测量科研报告：

使用线粒体特异性染料JC-1检测线粒体膜电位（Δψm），在荧光显微镜下观察并定量分析。

凋亡测定

使用Tunel染色法测量成纤维细胞的凋亡水平，通过488nm激发和530nm发射观察Tunel标记的细胞，并在Staurosporine处理后进行凋亡诱导。

统计分析

使用SPSS 24.0软件和GraphPad Prism 8进行统计分析，定量数据以平均值±标准差表示，数据采用单尾学生T检验分析，p值小于0.05被认为具有显著统计意义。

研究结果

AIFM1基因变异的鉴定

基因组DNA测序显示患者体内存在AIFM1基因的c.1019T > C错义变异。在氨基酸守恒性分析中，发现该位点所在序列在多个物种中高度保守，且变异导致氨基酸由甲硫氨酸变为苏氨酸（p. Met340Thr）。根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）指南，该变异被分类为“可能致病性”变异。

线粒体异常

患者二头肌活检显示肌纤维大小不一致，MGT染色显示少量红色胞膜下片状区，说明线粒体聚集异常。COX染色显示少量COX降低的纤维，SDH/COX双染显示的异常蓝色纤维证明了线粒体异常存在。ATPase染色显示轻微的重新神经化现象。

AIFM1和线粒体复合物亚单位的表达量下降

免疫组织化学染色和Western Blot结果显示，患者肌肉组织和皮肤成纤维细胞中AIFM1的表达量显著降低。同时，肌肉组织中I型复合物的NDUFB8亚单位和III型复合物的CYTB亚单位表达显著下降。

线粒体呼吸功能障碍

通过Seahorse分析仪测得患者成纤维细胞的基础呼吸、ATP生成、质子泄漏、最大呼吸和备用呼吸能力均显著降低。复合物I、II、IV介导的呼吸在突变细胞中显著减少。

核黄素缺乏诱导AIFM1下调

在核黄素缺乏条件下，突变体和野生型成纤维细胞中AIFM1的水平逐渐下降，且突变体细胞下降更明显。高浓度的核黄素（2和20mg/L）能够部分增加AIFM1的水平。

临床症状的改善

给予患者每天100mg的核黄素治疗10个月后，患者共济失调和肌肉无力有明显改善，其国际共济失调评分（ICARS）改善了19%。

结论

本研究验证了AIFM1基因c.1019T > C变异的致病性，导致线粒体功能障碍且对此变异的细胞对核黄素缺乏不耐受。核黄素补充对维持AIFM1蛋白水平和线粒体呼吸功能有帮助。早期核黄素治疗可能对AIFM1变异患者具有一定的治疗价值。

研究意义

本研究为AIFM1基因变异导致的线粒体疾病提供了新的科学证据，强调了早期核黄素治疗的重要性，并为未来临床治疗提供了参考。