circPTP4A2通过miR-20b-5p/YTHDF1/TIMP2轴促进脑缺血性中风中的小胶质细胞极化

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缺血性中风 小胶质细胞极化 circPTP4A2 miR-20b-5p TIMP2

科学论文《circptp4a2通过mir‑20b‑5p/ythdf1/timp2轴在脑缺血性中风中促进小胶质细胞极化》的学术报道

背景介绍

脑缺血性中风（ischemic stroke, IS）是由于脑血流阻塞导致的脑组织坏死，是全球导致残疾和死亡的第二大原因。当前的临床治疗策略主要包括静脉溶栓和机械取栓，但这些方法的疗效有限。因此，开发新的有效治疗策略具有重要意义。小胶质细胞作为脑内常驻巨噬细胞，在急性和慢性神经炎症反应中起重要作用。在脑缺血性中风的病理阶段，小胶质细胞能迅速激活并分化为M1或M2表型，这两种表型分别在组织损伤和修复中发挥不同的功能。

特别地，M1小胶质细胞通过分泌促炎因子促进脑损伤，而M2小胶质细胞则分泌抗炎因子，具有神经保护作用。因此，促进小胶质细胞向M2表型极化被认为是治疗脑缺血性中风的潜在策略之一，理解小胶质细胞M2表型极化的机制是实现这一目标的关键步骤。

论文来源

此论文由哈尔滨医科大学第一附属医院急诊医学科的Xianxin Kang、Yanhui Cao、Guodong Sun、Dongsheng Fei、Kai Kang、Xianglin Meng和Mingyan Zhao等人撰写，并于2023年9月14日在《Neuromolecular Medicine》期刊在线发表。

研究流程

研究中，作者们通过构建MCAO/R（中脑动脉闭塞/再灌注）和OGD/R（氧糖剥夺/再氧合）模型，探讨了circPTP4A2在脑缺血性中风中调控小胶质细胞极化的作用。

实验步骤

  1. 临床样本收集

    • 从30名脑缺血性中风患者和30名健康志愿者中收集血液样本。
    • 包含患者是否为首次发病等基本特征信息。

  2. MCAO/R模型建立

    • 使用8周龄的C57BL/6小鼠（共32只），分为4组：sham组，MCAO/R组，MCAO/R+sh-NC组和MCAO/R+sh-circPTP4A2组。
    • 在小鼠中构建MCAO/R模型，并进行shRNA干扰以敲低circPTP4A2。

  3. 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色

    • 检测小鼠脑组织中的梗死体积。
    • 通过神经功能评分评估神经损伤。

  4. 免疫荧光染色

    • 分析脑组织中CD16和CD206的表达水平。

  5. 细胞培养与处理

    • 使用从ATCC购买的人小胶质细胞（HMC3细胞），在OGD/R条件下构建体外模型。
    • 进行各种转染实验，包括shRNA干扰和mir-20b-5p微小RNA的模拟和抑制。

  6. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法

    • 测量细胞活力。

  7. 流式细胞术

    • 检测细胞表面CD16和CD206的表达。

  8. RNA免疫共沉淀（RIP）实验

    • 分析细胞中circPTP4A2与mir-20b-5p和YTHDF1的相互作用。

  9. RNA下拉实验

    • 进一步验证mir-20b-5p与YTHDF1之间的结合。

  10. 双萤光素酶报告基因实验

    • 验证mir-20b-5p与YTHDF1的结合位点。

  11. 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

    • 检测目标RNA的表达水平。

  12. 蛋白质印迹

    • 检测小鼠和细胞中的相关蛋白表达，包括TIMP2和NF-κB通路相关蛋白。

研究结果

  1. circPTP4A2和mir-20b-5p的表达

    • circPTP4A2在脑缺血性中风患者血浆中的表达显著上调，而mir-20b-5p则显著下调。

  2. circPTP4A2敲低对MCAO/R诱导的小鼠脑损伤的影响

    • TTC染色显示，敲低circPTP4A2可减少MCAO/R诱导的小鼠脑梗死体积，减轻神经损伤。
    • 免疫荧光染色和蛋白质印迹分析表明，敲低circPTP4A2能促进小胶质细胞M2极化，减少M1标志物（iNOS，CD16）的表达，同时增加M2标志物（Arg1, CD206）的表达。

  3. circPTP4A2通过mir-20b-5p调控YTHDF1的表达

    • 通过双萤光素酶报告基因、RNA下拉和RIP实验验证，circPTP4A2作为mir-20b-5p的海绵，调控YTHDF1的表达。
    • 实验结果表明，敲低circPTP4A2或YTHDF1均可降低TIMP2的表达，并抑制NF-κB通路的激活。

  4. mir-20b-5p通过调控TIMP2调节OGD/R诱导的小胶质细胞极化

    • mir-20b-5p过表达可促进小胶质细胞M2极化，减少TIMP2的表达，此效应可被TIMP2的过表达逆转。

结论与意义

本研究首次发现，circPTP4A2通过抑制mir-20b-5p进而调控YTHDF1表达，在脑缺血性中风的进程中，促进小胶质细胞向M2表型极化，减少神经炎症，减轻神经损伤。这一发现为脑缺血性中风的新型治疗策略提供了理论基础，其中circPTP4A2、mir-20b-5p和YTHDF1可作为潜在的治疗靶点。

研究亮点

  1. 新发现的调控轴

    • circPTP4A2/mir-20b-5p/YTHDF1/TIMP2轴的发现，揭示了小胶质细胞极化的新机制。

  2. 潜在的临床应用

    • 该研究为开发新的脑缺血性中风治疗策略提供了基础，circPTP4A2可能成为未来治疗的靶点。

  3. 丰富的实验设计

    • 结合体内和体外模型，验证了不同实验方法的一致性，提高了结论的可靠性。