Comparaison entre SaCas9 et SpCas9 pour une haute fidélité et différents résultats d’édition génique

Contexte de la recherche

Les systèmes CRISPR basés sur la protéine Cas9 sont devenus des outils puissants pour l’édition génomique, largement utilisés dans la recherche fondamentale et la thérapie génique clinique. Actuellement, les variantes de Cas9 les plus couramment utilisées sont SpCas9 de Streptococcus pyogenes et SaCas9 de Staphylococcus aureus. Bien que ces deux protéines Cas9 aient été largement validées dans de nombreuses études, une comparaison systématique de leurs effets spécifiques d’édition génique fait encore défaut. Par conséquent, cet article vise à comparer systématiquement l’efficacité et la précision de SpCas9 et SaCas9 dans l’édition génique, et à explorer leurs performances d’édition sous différentes longueurs de coupure.

Source de la recherche

Cet article a été rédigé par des chercheurs de plusieurs institutions, dont l’Institut d’Hématologie de l’Académie Chinoise des Sciences Médicales, notamment Zhi-Xue Yang, Ya-Wen Fu, Jian-Ping Zhang, et al. Les résultats de la recherche ont été publiés dans la revue “Genomics, Proteomics & Bioinformatics” en 2023.

Processus de recherche

Le processus de recherche peut être divisé en plusieurs étapes :

1. Conception de l’étude et sélection des séquences cibles génomiques :

   • Utilisation de l’outil ChopChop pour concevoir des séquences sgRNA ciblant les gènes humains AAVS1, ALB, B2M1, etc.
   • Détermination des séquences PAM (NGGRRT) reconnues simultanément par Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) et Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)

2. Culture cellulaire et électroporation :

   • L’étude inclut des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSCs) et des cellules leucémiques K562, les deux types de cellules étant cultivés et électroporés de manière standardisée
   • Utilisation du système Lonza 2b pour l’électroporation, introduisant le plasmide Cas9-sgRNA dans les cellules

3. Évaluation de l’efficacité de l’édition génique :

   • Amplification des séquences cibles par PCR primaire et secondaire, suivie d’un séquençage profond Illumina
   • Utilisation de l’outil CRISPResso2 pour analyser la fréquence d’édition, l’efficacité HDR et le taux d’insertion dsODN

4. Séquençage à haut débit et analyse des données :

   • Utilisation de l’analyse Guide-seq pour évaluer la spécificité à l’échelle du génome
   • Analyse précise des résultats de réparation des cassures double-brin induites par Cas9, en se concentrant sur les mécanismes de réparation NHEJ, MMEJ et HDR

Résultats de la recherche

Efficacité d’édition de SpCas9 et SaCas9 avec différentes longueurs de Spacer

L’étude montre que :

1. La longueur optimale du Spacer pour SpCas9 est de 20 nt, avec des longueurs de Spacer de 18, 19 et 21 nt montrant une activité plus élevée dans un petit nombre de cas (comme AAVS1c et B2M1).

2. SaCas9 est plus sensible aux changements de longueur du Spacer, la longueur la plus efficace étant de 21-22 nt. Lorsque la longueur du Spacer atteint 23 nt, l’efficacité d’édition diminue significativement.

Différences dans les résultats d’édition génique et les types de réparation

1. Fréquence des insertions-délétions (Indel) :

   • Dans les cellules iPSCs et K562, SaCas9 a montré une fréquence d’Indel plus élevée sur la plupart des cibles.

2. Caractéristiques de réparation NHEJ :

   • SaCas9 produit environ 10 fois moins de mutations d’insertion +1 (en particulier +T) sous réparation NHEJ que SpCas9, réduisant les mutations causées par la coupure décalée. Cela fournit de meilleures conditions pour l’insertion de DSODN et l’édition HDR.

3. Efficacité HDR et efficacité d’insertion :

   • En moyenne, SaCas9 présente une efficacité d’édition significativement plus élevée que SpCas9 pour l’insertion de gènes (par exemple, DSODN) et HDR (par exemple, AAV6-donor).

Effets hors cible

• L’analyse Guide-seq a montré que SaCas9 avait significativement moins de sites hors cible totaux que SpCas9 dans les cellules iPSCs et K562, indiquant une plus grande spécificité de SaCas9 dans l’édition génique in vitro. L’édition avec SaCas9 utilisant un spacer de 22 nt a montré une activité hors cible encore plus faible.

Conclusion

Les résultats de cette étude démontrent la supériorité de SaCas9 par rapport à SpCas9 dans plusieurs aspects de l’édition génique. En particulier, SaCas9 a montré une meilleure efficacité et précision d’édition en termes de préférence de coupure décalée, de résultats de réparation NHEJ et d’effets hors cible. Cette étude fournit un support théorique important et des orientations pratiques pour le choix et l’utilisation d’outils dans l’édition génique, en particulier dans la thérapie génique clinique.

Points forts de la recherche

• Effets hors cible significativement plus faibles : L’analyse de séquençage à haut débit par Guide-seq a montré que le système SaCas9 présente un risque significativement réduit d’effets hors cible dans l’édition génique par rapport à SpCas9.
• Méthodes pour améliorer l’efficacité d’édition : Cette étude a conçu et validé une protéine de fusion Cas9 optimisée, utilisant des éléments NLS et HMGA2, qui a significativement amélioré l’efficacité de l’édition génique.
• Conception expérimentale et analyse détaillées : Cette étude a évalué en détail l’efficacité de knock-out et les mécanismes de réparation de Cas9-sgRNA avec différentes longueurs de Spacer, fournissant une référence importante pour la conception future d’expériences d’édition génique.

Signification de la recherche

Cette étude compare systématiquement les performances de SpCas9 et SaCas9 dans l’édition génique, ce qui est d’une grande importance pour le développement de l’édition génique de précision et de la thérapie génique. La protéine SaCas9 est hautement spécifique et préfère générer des extrémités franches, ce qui lui confère un avantage dans les applications de thérapie génique clinique, en particulier dans les domaines thérapeutiques sensibles aux effets hors cible.