La technologie d’édition génétique CRISPR-Cas9 a fait des progrès significatifs dans le traitement du cancer, en particulier dans le développement des cellules T à récepteur d’antigène chimérique (CAR-T). Cependant, les anomalies chromosomiques potentielles induites par l’édition CRISPR, telles que les grandes délétions, les translocations chromosomiques et l’aneuploïdie, sont devenues un problème majeur dans les applications cliniques. Bien que des études aient déjà cherché à réduire ces risques en optimisant les composants du système CRISPR-Cas9, les caractéristiques intrinsèques des cellules T, telles que l’expansion rapide après l’activation du récepteur des cellules T (TCR), n’ont pas été suffisamment étudiées en ce qui concerne leur impact sur la sécurité génomique. Par conséquent, Laurenz T. Ursch et ses collègues ont mené cette étude pour explorer l’influence de l’activation du TCR et de la prolifération cellulaire sur les résultats de l’édition CRISPR, et pour trouver des stratégies visant à améliorer la sécurité génomique des cellules T modifiées par CRISPR.

Origine de l’article

Cet article a été co-écrit par Laurenz T. Ursch, Jule S. Müschen, Julia Ritter et d’autres auteurs, issus de l’Université technique de Munich (Technical University of Munich), du Centre médical de l’Université de Fribourg (University of Freiburg Medical Center) et d’autres institutions. L’article a été publié le 17 décembre 2024 dans la revue Cell Reports Medicine, sous le titre “Modulation of TCR Stimulation and Pifithrin-α Improves the Genomic Safety Profile of CRISPR-Engineered Human T Cells”.

Processus et résultats de la recherche

Processus de recherche

1. Relation entre l’activation des cellules T et les résultats de l’édition CRISPR
   L’étude a d’abord comparé les résultats de l’édition CRISPR dans les cellules T CD4 activées et non activées. En ciblant le gène de refuge sûr AAVS1, le récepteur de surface CD4 et le récepteur dépendant de l’activation PD-1, les chercheurs ont utilisé des ribonucléoprotéines Cas9 (Cas9 RNPs) pour l’édition. Après l’édition, les cellules T ont été divisées en un groupe non activé et un groupe activé par des anticorps anti-CD3/CD28. Quatre jours plus tard, les niveaux d’expression des protéines CD4 et PD-1 ont été mesurés par cytométrie en flux, et l’efficacité de l’édition d’AAVS1 a été analysée par séquençage de nouvelle génération (NGS). Les résultats ont montré que les cellules T activées avaient une efficacité de knock-out plus élevée aux loci CD4 et PD-1, mais avec des délétions plus importantes.

2. Relation entre la vitesse de prolifération des cellules T et la taille des délétions
   Les chercheurs ont ensuite exploré l’influence de la vitesse de prolifération des cellules T sur les résultats de l’édition CRISPR. En utilisant le colorant CFSE pour marquer les cellules T CD4, et en les divisant en groupes à prolifération rapide et lente selon le modèle de dilution du CFSE, les résultats ont montré que les cellules T à prolifération rapide produisaient des délétions plus importantes après l’édition, tandis que les cellules à prolifération lente présentaient des délétions plus petites.

3. Impact du Pifithrin-α sur les résultats de l’édition CRISPR
   Les chercheurs ont testé l’effet de deux inhibiteurs de p53, le Pifithrin-α (PFT-α) et le Pifithrin-m (PFT-m), sur les résultats de l’édition CRISPR. Les résultats ont montré que le PFT-α réduisait la taille des délétions dans les cellules T activées, tandis que le PFT-m augmentait légèrement les délétions. Des études supplémentaires ont montré que l’effet du PFT-α était indépendant de p53 et qu’il maintenait la fonctionnalité des cellules T modifiées par CRISPR.

4. Impact du PFT-α sur la fonction des cellules T
   Pour évaluer le potentiel clinique du PFT-α, les chercheurs ont examiné la fonction des cellules T traitées avec du PFT-α in vitro et in vivo. Les résultats ont montré que les cellules T traitées avec du PFT-α ne présentaient pas de différences significatives dans la sécrétion de cytokines, la composition des sous-populations de cellules T et la capacité de destruction des cellules tumorales par rapport au groupe témoin.

5. Impact du PFT-α sur les anomalies chromosomiques et l’aneuploïdie
   En utilisant le séquençage PCR médié par liaison ciblée unique (CAST-seq) et le séquençage du caryotype à cellule unique (scKaryo-seq), les chercheurs ont découvert que le PFT-α réduisait significativement les translocations chromosomiques et l’aneuploïdie induites par l’édition CRISPR.

Principaux résultats

1. Relation entre l’activation des cellules T et la taille des délétions
   Les cellules T activées produisaient des délétions plus importantes après l’édition CRISPR, tandis que les cellules non activées présentaient des délétions plus petites.

2. Relation entre la vitesse de prolifération des cellules T et la taille des délétions
   Les cellules T à prolifération rapide produisaient des délétions plus importantes après l’édition, tandis que les cellules à prolifération lente présentaient des délétions plus petites.

3. Impact du PFT-α sur la taille des délétions
   Le PFT-α réduisait la taille des délétions dans les cellules T activées, et cet effet était indépendant de p53.

4. Impact du PFT-α sur la fonction des cellules T
   Les cellules T traitées avec du PFT-α ne présentaient pas de différences significatives dans la sécrétion de cytokines, la composition des sous-populations de cellules T et la capacité de destruction des cellules tumorales par rapport au groupe témoin.

5. Impact du PFT-α sur les anomalies chromosomiques et l’aneuploïdie
   Le PFT-α réduisait significativement les translocations chromosomiques et l’aneuploïdie induites par l’édition CRISPR.

Conclusion et signification

Cette étude montre que l’activation du TCR et la prolifération cellulaire sont des facteurs clés dans les anomalies chromosomiques induites par l’édition CRISPR. En contrôlant l’activation des cellules T et en ajoutant du PFT-α, il est possible d’améliorer significativement la sécurité génomique des cellules T modifiées par CRISPR. Le PFT-α réduit non seulement la taille des délétions, mais maintient également la fonctionnalité des cellules T, offrant ainsi une nouvelle stratégie pour les applications cliniques des cellules T modifiées par CRISPR.

Points forts de la recherche

1. Découverte importante
   L’activation du TCR et la prolifération cellulaire sont des facteurs clés dans les anomalies chromosomiques induites par l’édition CRISPR, et le PFT-α peut réduire ces anomalies sans affecter la fonction des cellules T.

2. Innovation méthodologique
   L’étude explore systématiquement pour la première fois l’influence de l’activation et de la prolifération des cellules T sur les résultats de l’édition CRISPR, et propose une stratégie pour améliorer la sécurité génomique en contrôlant l’activation des cellules T et en ajoutant du PFT-α.

3. Valeur applicative
   Cette recherche offre une nouvelle garantie de sécurité pour les applications cliniques des cellules T modifiées par CRISPR, avec une importance scientifique et applicative significative.

Autres informations utiles

L’étude explore également les effets spécifiques du PFT-α dans différents sous-groupes de cellules T, et constate que les effets du PFT-α varient selon les sous-groupes. De plus, l’efficacité des cellules T traitées avec du PFT-α dans le traitement des tumeurs a été validée par des expériences in vitro et in vivo.