Application ciblée des mitochondries basée sur les indicateurs de tension codés génétiquement (GEVIs)

Contexte et motivation de la recherche

Les mitochondries, en tant qu’usines énergétiques des cellules eucaryotes, jouent un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, notamment la conversion bioénergétique, la synthèse des métabolites, la survie cellulaire, le stockage du calcium et la production de chaleur. Dans les organes nécessitant un métabolisme aérobie important, comme le cerveau et le cœur, le fonctionnement normal des mitochondries est particulièrement crucial. Le maintien du potentiel de membrane au repos des neurones et des cellules myocardiques nécessite une grande quantité d’énergie, principalement réalisée par la pompe sodium-potassium (Na+/K+ ATPase). La membrane interne mitochondriale contient des transporteurs, des canaux ioniques et des pompes ioniques responsables du transport de diverses substances, générant et influençant ainsi le potentiel de membrane mitochondriale (MMP, ψm). ψm est lié à diverses physiologies cellulaires, notamment la production d’énergie, la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), la promotion du transport transmembranaire des substrats métaboliques et des ions, etc. De plus, ψm affecte la morphologie mitochondriale et participe à des processus tels que la mitophagie et l’apoptose.

Les méthodes actuelles de mesure du potentiel de membrane mitochondriale (Δψm) reposent sur la distribution de colorants cationiques lipophiles. Cependant, il n’existe pas encore d’indicateurs fluorescents codés génétiquement (GEVIs) pour le MMP. Cette étude tente de combler cette lacune en visant à sélectionner et développer un GEVI capable de cibler les mitochondries et de surveiller les changements dynamiques de leur potentiel de membrane.

Source de l’étude et informations sur les auteurs

Cet article a été rédigé par Run-Zhou Yang, Dian-Dian Wang, Sen-Miao Li, Pei-Pei Liu et Jian-Sheng Kang, entre autres. Les institutions de recherche comprennent le Laboratoire de biologie systémique clinique du premier hôpital affilié de l’Université de Zhengzhou, le département de neurologie du premier hôpital affilié de l’Université de Zhengzhou et la faculté de médecine de l’Université de Zhengzhou. Cette étude a été publiée dans Neurosci. Bull. en 2024.

Processus et méthodes de recherche

Sujets de recherche et conception expérimentale

L’étude a d’abord sélectionné quatre GEVIs, dont Arclight et ASAP1 dérivés de la GFP, et Somoarchon et PROPS dérivés de la rhodopsine. Ces GEVIs ont été ciblés vers les mitochondries en fusionnant une séquence de signal de ciblage mitochondrial (mt, 4cox8) à leur extrémité N-terminale. L’étude a évalué l’efficacité du ciblage mitochondrial de ces GEVIs et vérifié leur sensibilité à la tension par des expériences cellulaires.

Culture cellulaire et transfection

L’expérience a utilisé des cellules HEK293T, COS-7 et HeLa, cultivées dans du milieu de Eagle modifié de Dulbecco contenant 10% de sérum fœtal bovin, et maintenues à 37°C dans un environnement à 5% CO2/95% air. Pour une expression à court terme, la transfection cellulaire a été réalisée par la méthode de précipitation au phosphate de calcium.

Imagerie cellulaire et analyse de colocalisation

L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, et l’analyse de colocalisation a été effectuée avec le logiciel ImageJ, en quantifiant le coefficient de corrélation de Pearson pour évaluer l’efficacité du ciblage mitochondrial.

Isolation et culture des cardiomyocytes primaires et des neurones

L’expérience a utilisé des cœurs et des hippocampes de souris C57BL âgées de 0 jour pour la dissection des tissus, en utilisant de la trypsine et de la collagénase pour digérer les tissus, et en dissociant davantage les cellules avec des pipettes polies avant de les planter sur des lamelles recouvertes de Matrigel. Les cardiomyocytes ont commencé à battre spontanément après 24 heures, et les cellules du tissu hippocampique ont été obtenues par dissociation supplémentaire et centrifugation pour obtenir des cellules individuelles, puis plantées et cultivées.

Préparation et transduction des virus

Des virus adéno-associés (AAV) et des lentivirus ont été utilisés pour transduire les cardiomyocytes et les neurones. Les virus ont été préparés par transfection de cellules HEK293T par la méthode de précipitation au phosphate de calcium, et extraits par la méthode des cycles de congélation-décongélation.

Construction de lignées cellulaires stablement transfectées

Des lignées cellulaires stablement transfectées ont été construites par transduction lentivirale suivie d’une sélection. Les cellules ont été cultivées dans un milieu contenant de la puromycine, et la présence de la séquence du plasmide a été vérifiée par PCR et séquençage.

Électrophysiologie et imagerie de tension

Les enregistrements de patch-clamp en configuration cellule entière ont été réalisés à température ambiante, en utilisant un système photoélectrique personnalisé avec un taux d’acquisition de données de 10 kHz. L’activité cellulaire a été enregistrée en mode voltage-clamp, et le mode de déclenchement de la caméra a été réglé pour capturer les impulsions de tension.

Imagerie de cellules vivantes

Les cellules ont été imagées sous un microscope à fluorescence dans une solution tampon de Tyrode, avec acquisition d’images en mode flux. Pour capturer les fluctuations de tension spontanées, les images ont été acquises en mode flux.

Système de criblage in vitro

Un promoteur T5 et une séquence Shine-Dalgarno ont été insérés dans le vecteur pcDNA3.1(-) pour permettre l’expression dans les cellules procaryotes et mammifères. Les clones bactériens à haute fluorescence ont été sélectionnés par PCR et analyse de séquence pour une analyse plus approfondie.

Résultats expérimentaux

Criblage et validation

Dans les cellules HeLa ou COS-7, l’étude a révélé que parmi les GEVIs, mt-ASAP1 présentait la plus haute efficacité de ciblage mitochondrial et montrait une sensibilité à la tension. De plus, mt-ASAP1 s’est avéré sensible aux ROS dans les cardiomyocytes. Par diverses mutations, l’étude a développé un mutant ASAP3-st avec une haute sensibilité à la tension et insensible aux ROS.

Diminution du potentiel de membrane mitochondrial

Au cours de l’anesthésie, des expériences de fibrophotométrie ont révélé que l’anesthésie provoquait une dépolarisation mitochondriale, que mt-ASAP3-st pouvait efficacement surveiller.

Conclusion

Cette étude a réussi à développer quatre GEVIs capables de cibler les mitochondries et a vérifié leur sensibilité à la tension et aux ROS dans divers types cellulaires. Les résultats de l’étude contribuent à une meilleure compréhension du rôle des mitochondries dans différents processus physiologiques et pathologiques, et fournissent un outil de criblage à haut débit pour le développement de nouveaux médicaments visant à traiter les dysfonctionnements mitochondriaux.

Points forts de la recherche

1. Développement de quatre indicateurs de tension codés génétiquement ciblant les mitochondries (MPI-1 à MPI-4) et validation de leur application dans divers types cellulaires.
2. Découverte et résolution du problème de sensibilité aux ROS de mt-ASAP1 dans les cardiomyocytes, avec développement de mt-ASAP3-st insensible aux ROS par mutation.
3. Première détection in vivo de la dépolarisation de la membrane mitochondriale induite par l’anesthésie grâce à des expériences de fibrophotométrie, offrant une nouvelle perspective sur l’impact des anesthésiques sur la fonction mitochondriale.

Signification de la recherche

Cette étude enrichit non seulement les outils de surveillance du potentiel de membrane mitochondrial, mais fournit également de nouveaux moyens pour étudier en profondeur les processus physiologiques et pathologiques liés au métabolisme énergétique. Ces GEVIs ont un large potentiel d’application dans le criblage de médicaments, l’étude de modèles de maladies et la recherche en biologie fondamentale.