複合体I組み立ておよびミトコンドリア疾患におけるNDUFAF6の体系的解析

2024-06-07 Fri
ミトコンドリア病複合体I欠陥 NDUFAF6 アセンブリ因子生化学的解析病原性変異
システム分析NDUFAF6の複合体I組み立てとミトコンドリア病における役割背景紹介ミトコンドリア複合体I（complex I, CI）は呼吸鎖の中で重要な構成要素であり、酸化的リン酸化（oxphos）過程において電子をミトコンドリア呼吸鎖に導入し、複合体II-IVと共にATP合成を駆動するプロトングラデントを生成・維持します。研究によれば、単独のCI欠損が主要なミトコンドリア病の最も一般的な原因の一つを構成しており、約5000人に1人が影響を受けています。CI欠損の約半分は、CIアセンブリ因子（CI assembly factors, CIAFs）に影響を与える病的変異によって引き起こされると考えられており、これらの因子はCI全酵素の一部ではありません。これらのCIAFsのCI疾患の発症メカニズムにおける役割は顕著ですが、その正確な分子機能は未解明であり、これにより機構研究が複雑化され、潜在的な病的遺伝子変異の解釈と診断が難しくなっています。
出典紹介この研究は《Nature Metabolism》誌に発表され、タイトルは「Systematic analysis of NDUFAF6 in Complex I Assembly and Mitochondrial Disease」であり、doiはhttps://doi.org/10.1038/s42255-024-01039-2です。論文の著者にはアンドリュー・Y・サン（Andrew Y. Sung）、レイチェル・M・ゲラ（Rachel M. Guerra）、ローラ・H・ステーンベルゲ（Laura H. Steenberge）などが含まれ、彼らはアメリカのウィスコンシン大学医学院、セントルイス・ワシントン大学医学院、イギリスのニューカッスル大学医学科学部、ドイツのミュンヘン工科大学人類遺伝学研究所など多数の著名な研究機関から来ています。研究期間は2023年9月6日に始まり、2024年3月28日に受理され公表されました。
研究プロセスと方法の紹介ディープミューテーションスキャンのワークフロー研究チームは、NDUFAF6遺伝子の数千種類の変異の機能を系統的に評価するためのディープミューテーションスキャン（DMS）を設計しました。彼らは以下の実験手順を利用しました：
NDUFAF6遺伝子ノックアウトHEK293T細胞株の作成： 研究者たちはまずCRISPR-Cas9技術を使用して、2つの独立したaf6遺伝子ノックアウト（KO）細胞株を作成し、Sangerシーケンシング、西部プロット、およびゲル内CI活性測定によってこれらのKO細胞株がaf6およびCIを欠如していることを確認しました。
変異ライブラリの生成およびトランスフェクション： 研究者たちは、NDUFAF6の全可能変異をカバーする変異ライブラリを合成し、それをレンチウイルスベクターにクローンニングしてaf6 KO細胞株にトランスフェクションしました。
機能的変異体のスクリーニングと選択： 変異NDUFAF6変異体を含むKO細胞を転入し、主要な炭素源としてガラクトースを含む培地でスクリーニングを行い、ガラクトース培地で生育可能な機能的変異体をスクリーニングしました。
ディープシーケンシング解析： 高スループットシーケンシング技術を使用して、ガラクトース生育選択の前後で各変異の読み取り数を解析し、変異体の適応スコアを計算しました。
研究結果は、非常に高いシーケンシング深度、高度に相関する適応スコア、および期待される構造モデルとの良好な一致を含むさまざまな方法で、彼らの変異スキャンデータの質を検証しました。
タンパク質-タンパク質相互作用解析研究チームは、ディープミューテーションスキャンデータとAlphaFold予測のaf6モデルを結びつけ、一連の実験を行ってaf6の分子機能を探求しました。交差リンク質量分析技術を用いてaf6の可能な結合パートナーを特定し、af6が特異的に核CIサブユニットNDUFS8と結合することを発見しました。さらに、酵母二重雑種実験によってaf6表面変異がNDUFS8との相互作用に影響を与えるかどうかを検証した結果、af6とNDUFS8の特異的結合が特定の表面部位によって調節されることが示されました。
青ネイティブ電気泳動実験およびウエスタンブロッティングaf6がCIの組み立てにおいて媒介する役割を確認するため、研究者たちは、青ネイティブ電気泳動法を使用して、HAP1野生型およびCIAFノックアウト細胞株におけるQモジュールサブユニットおよび組み立て因子の移動パターンを追跡し、af6がNDUFS8の組み立てを促進することで125 kDaの中間生成物への移行に重要な役割を果たすことを発見しました。
主な結果af6の機能解明とNDUFS8の統合ディープミューテーションスキャンデータは、構造予測と組み合わせて、af6が疑似酵素としてCIサブユニットNDUFS8と直接結合し、125 kDaの中間生成物への統合を指導することを明らかにしました。さらに、NDUFS8を過剰発現することでaf6欠損による欠陥を救済できることが実験で示され、この特異的相互作用の潜在的治療方法が提案されました。
変異感受性の機能領域ディープミューテーションスキャンデータは、変異感受性が高い特定の蛋白質領域をも浮き彫りにし、これらの領域が機能的関連性を有することを示唆しました。例えば、af6のC末端ヘリックス構造はその膜結合性に重要であり、この膜結合性がCI組み立てに不可欠であることが示されました。
新病理変異の具象化この研究は、7種の新たなヒト病理学関連のaf6変異の病原性を実験で支持するとともに、5000種類を超える未注釈のaf6変異に機能的証拠を提供し、af6関連疾患の診断を支援するための臨床リソースを構築しました。
結論と意義この研究の新発見は、af6がCI組み立てにおける分子役割についての知識の空白を埋め、機能変異と疾病原因についての新たな診断リソースを提供します。さらに、本研究は、既存のNDUFS8レベルを調節することでaf6機能異常を直接補償する潜在的治療経路を提案しました。ディープミューテーションスキャンデータはまた、ACMG（米国医学遺伝学およびゲノム学会）フレームワーク下での変異解釈を改善し、いくつかの既存変異の分類を向上させ、新たに7種の病的変異を確立しました。
研究ハイライトaf6を疑似酵素として機能識別： 本研究は、af6が酵素活性ではなく、タンパク質-タンパク質相互作用を介してCIの組み立てを媒介することを確認しました。
新しい方法と技術の応用： ディープミューテーションスキャンの系統的手法は、未知の機能を持つミトコンドリアタンパク質の研究に新しいツールを提供しました。
臨床応用価値： af6関連疾患の診断をより正確に行うための広範な機能変異データを提供し、新たな治療戦略の開発を支援します。
この研究の成功は、ミトコンドリアタンパク質組み立て因子の機能を深く理解する重要性を示し、他の未解明のミトコンドリアタンパク質の研究に対して貴重な実験フレームワークと方法論的示唆を提供します。