LOXL1-AS1によるJAK2/STAT3シグナル経路の調節を介した胆管癌の進行促進

学術的背景

胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）は胆管上皮に由来する悪性腫瘍であり、著しい医学的課題を有しています。発症率は地理的に明らかに異なり、特にアジアと南米で高いです。CCAの発生は、胆嚢炎、胆石症、肝硬変、および肝炎ウイルス感染など複数の要因と関連しています。初期症状が隠れやすいため、多くの患者は診断時に既に末期に達しており、手術切除の効果が低く、予後が非常に悪いです。現在、CCAの発生メカニズムに関する詳細な研究が急務となっており、効果的な標的治療法の開発を通じて患者の生存率および生活の質を向上させることが求められています。長鎖非コードRNA（lncRNA）は200以上のヌクレオチドを有するRNA分子で、タンパク質をコードしないことからその名がついています。最近の研究では、lncRNAが腫瘍の発生や発展を含む多くの生物学的過程で重要な調節役を果たすことが示されています。

出典

この研究は、黒龍江省ハルビン医科大学附属第二病院の研究チームによって行われました。主な著者にはShaobo Yu、Xin Gao、Sidi Liuなどが含まれます。研究は2024年の《Cancer Gene Therapy》に発表されました（DOI: https://doi.org/10.1038/s41417-024-00726-2）。

研究の流れ

臨床サンプル

2013年1月から2018年7月までにハルビン医科大学附属第二病院で収集した65組の胆管癌患者の腫瘍組織および対応する非腫瘍組織サンプルを採取しました。これらのサンプルは手術後すぐに凍結され、-80°Cで保存されました。すべての患者はインフォームドコンセントに署名し、倫理委員会の承認を得ています。

細胞培養とトランスフェクション

正常胆管細胞系HIBECおよび胆管癌細胞系CCLP-1、QBC939、RBE、およびHuCCT1を培養し、LOXL1-AS1のノックダウンおよび過剰発現をsiRNAとプラスミドを用いて実施しました。

qRT-PCR

細胞および組織サンプルから総RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、qRT-PCR分析を行い、ターゲット遺伝子の発現レベルを測定しました。

細胞生存実験

CCK-8およびEdU実験を用いて細胞生存率を評価し、JC-1実験を通じてミトコンドリア膜電位を評価しました。

細胞アポトーシス検査

TUNEL実験およびフローサイトメトリーを用いて細胞アポトーシス率を検査しました。

細胞移行と侵襲実験

スクラッチ実験およびTranswell実験を使用して細胞の移行と侵襲能力を評価しました。

ウエスタンブロット

ウェスタンブロット実験を通じてJAK2/STAT3シグナル経路に関連するタンパク質の発現状況を分析しました。

細胞内局在実験

細胞内分離実験およびFISH実験を用いてLOXL1-AS1の細胞内局在を確認しました。

RNAプルダウン実験

RNAプルダウン実験およびRIP実験を通じてLOXL1-AS1とJAK2タンパク質の相互作用を確認しました。

体内実験

裸マウスに皮下腫瘍および転移モデルを確立し、H&E染色および免疫組織化学分析を行って評価しました。

主な結果

CCAにおけるLOXL1-AS1の高発現

胆管癌組織においてLOXL1-AS1の顕著な過剰発現が発見されました（図1a）。この高発現はTNMステージ、リンパ節転移および患者の予後と有意に関連していました（図1b-1e）。Kaplan-Meier法およびROC曲線を用いた評価により、LOXL1-AS1はCCA患者のDFSおよびOSと密接に関連していることが示されました（図1f）。

LOXL1-AS1による腫瘍増殖とアポトーシスの制御

CCK-8およびEdU実験を通じて、LOXL1-AS1のノックダウンにより胆管癌細胞の増殖が有意に抑制されることがわかりました（図2c-2d）。一方、LOXL1-AS1の過剰発現はその増殖を促進しました。TUNELおよびJC-1実験の結果、LOXL1-AS1のノックダウンは胆管癌細胞のアポトーシスを有意に促進することが示されました（図2e-2f）。マウス体内実験では、LOXL1-AS1のノックダウンが腫瘍成長を顕著に抑制しました（図2g-2h）。

LOXL1-AS1による移行と侵襲への影響

スクラッチ実験およびTranswell実験を通じて、LOXL1-AS1のノックダウンが胆管癌細胞の移行および侵襲能力を有意に抑制することがわかりました（図3a-3c）。EMTマーカーの発現分析では、LOXL1-AS1がEMTプロセスの開始と緊密に関連していることが示されました（図3d）。体内実験においても、LOXL1-AS1のノックダウンが肝肺転移を有意に減少させました（図3e-3f）。

LOXL1-AS1のJAK2/STAT3シグナル経路の調節

実験の結果、LOXL1-AS1は主に細胞質に局在することが発見されました（図4a-4b）。さらに生物情報学的分析および実験結果から、LOXL1-AS1はJAK2のリン酸化状態を調整することにより、JAK2/STAT3シグナル経路に影響を与えることが示されました（図4c-4d）。

LOXL1-AS1がJAK2のユビキチン化分解に与える影響

RNAプルダウンおよびRIP実験を通じて、LOXL1-AS1とJAK2の直接的な結合が確認されました（図5a-5b）。LOXL1-AS1のノックダウン後、JAK2タンパク質の分解が促進されましたが、プロテアソーム阻害剤MG132を使用することで、JAK2タンパク質の分解が阻止されました（図5d-5e）。さらにCO-IP実験により、LOXL1-AS1のノックダウンがJAK2のユビキチン化レベルを顕著に増加させることが示されました（図5f）。

LOXL1-AS1とYY1転写因子の関係

生物情報学的予測および実験的検証により、YY1がLOXL1-AS1の上流プロモーターE1およびE2サイトに結合し、主にE2サイトを通じてLOXL1-AS1の発現を調整することが示されました（図7a-7c）。LOXL1-AS1のノックダウンがCCA細胞機能に与える影響は、YY1の過剰発現によって逆転できることが示されました（図7d-7i）。

討論および結論

この研究は、LOXL1-AS1が胆管癌で高発現しており、臨床病理学的特徴および患者の予後と有意に関連していることを示しています。LOXL1-AS1はJAK2のユビキチン化分解を抑制し、JAK2/STAT3シグナル経路を活性化することでCCAの進行を促進します。YY1転写因子はLOXL1-AS1の発現を調整することで、CCAの悪性生物学的特性に影響を与えます。これらの発見は、CCAの発病メカニズムをさらに理解し、新たな治療戦略の開発につながる重要な手がかりを提供します。この研究は、LOXL1-AS1と他の分子間の相互作用および他のシグナル経路における役割をさらに探求する必要があることを示唆しており、より多くの患者群でその臨床的意義を検証することが求められます。