実験的自己免疫性脳炎における脊髄組織由来の細胞外小胞の特性

序論

多発性硬化症(MS)は中枢神経系(CNS)の慢性脱髄疾患であり、その病因や病気の進行を予測する方法は現在も研究中です。実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルで、アジュバントで活性化されたミエリン反応性T細胞がオリゴデンドロサイトを攻撃し、脊髄と視神経前部に神経炎症を引き起こします。

細胞外小胞(EVs)はすべての細胞から放出される膜で包まれた粒子であり、血液脳関門を双方向に通過できます。EVsは健康状態と病気の状態の両方でさまざまな機能を持ち、細胞間の通信、物質輸送、および免疫調節を行います。したがって、EVsはMSおよびEAEの研究において大きな興味を引き、潜在的な血漿バイオマーカーおよび治療キャリアと見なされています。しかし、病気に関連するEVsがCNSでどのように変化するかについてはほとんど理解されていません。この空白を解決するため、EAEの誘導前および誘導後の16日目と25日目におけるマウス脊髄由来のEVsの物理的およびタンパク質の構成における変化を分析しました。

材料および方法

本研究では、雌性C57BL/6Jマウスを使用し、MOG33-55ペプチドアジュバント免疫によってEAEモデルを誘導しました。16日目(EAE急性期)および25日目(EAE慢性期)にマウスの脊髄組織を分離収集し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と超遠心を組み合わせてEVsを純化しました。ナノ粒子追跡分析(NTA)および透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してEVsの物理的特性を特定しました。18-プレックス タンデム質量分析(TMT)技術を使用して、EAEの異なる時期のEVsのプロテオームを分析し、さまざまな生物情報学ツールを使用して後続の分析を実施しました。

結果

EVsの物理的特性

NTAおよびTEM分析の結果、正常なマウスと比較して、EAEマウスの脊髄由来EVsには粒子濃度、サイズ分布、および形態に明確な差異は見られませんでした。質量分析では、既知のEV標識タンパク質(例えば、CD81、CD9、CD63など)がEVsに濃縮され、細胞核、細胞質、およびほとんどのミトコンドリアタンパク質が分解されていることが確認されました。このことは、分離された粒子が確かにEVsであることを示しています。

EVsのプロテオームの変化

合計7010個のタンパク質が特定され、そのうち2823個がEAEのいずれかの時点で差異を示す発現をしました。主成分分析の結果、正常、急性期、および慢性期のEAEのEVsサンプルが3つの独立したクラスターに分かれることが示され、EVsのプロテオームが病気の進行中に動的に変化することが示されました。

正常対照と比較して、EAE急性期のEVsでは最も顕著に上昇したタンパク質は炎症反応に関連しており、抗原提示関連タンパク質(H2-D1など)、免疫関連GTPase(IIGP1など)、補体カスケードタンパク質(C3など)、およびトール様受容体などが含まれていました。一方、髄鞘タンパク質、マイクロフィラメント束形成関連タンパク質、および星状膠細胞マーカータンパク質BTBD17などのタンパク質は減少しました。慢性期のEVsの変化傾向は急性期と類似していましたが、その程度は小さかったです。

遺伝子オントロジー(GO)富集分析により、EAEの両方の時点で免疫反応に関連する経路が著しく上昇し、ATP合成、神経伝達物質の調節、および神経伝達物質小胞の循環に関連する経路が下方調節されたことが示されました。線形モデル分析でも、正常対照と比較して、EAE急性期のEVsにおいて免疫反応、補体カスケード、凝固カスケード、およびマクロファージの食作用に関連する経路タンパク質が上昇し、ATP合成とニューロン機能に関連する経路タンパク質が下方調節されることが確認されました。

EVsの免疫細胞由来

生物情報学ツール予測分析により、EAEマウス脊髄EVs中の免疫細胞タイプの相対的な寄与が動的に変化することが明らかになりました。EAE誘導後、EVsにおけるT細胞、NK細胞、樹状細胞、単球/マクロファージ、および好中球の相対的な寄与は増加しました。さらに、EAE過程でのEVs中の調節性T細胞は相対的に減少し、活性化されたCD4メモリーT細胞は慢性期に顕著に増加しました。また、EVs中の促炎症性マクロファージマーカーのタンパク質は急性期には上昇し、慢性期には減少し、対照的に替代的に活性化されたマクロファージのタンパク質は慢性期に上昇しました。

ミエリンタンパク質とニューロンタンパク質の変化

EAEの過程で、EVs中の重要なミエリンタンパク質であるMBPおよびPLPのレベルが低下し、オリゴデンドロサイトの喪失を反映しました。末梢神経系のミエリンタンパク質であるMPZ、PMP2、および神経鞘の調節に関与するPRX、MPP6、NAALAD2などのタンパク質は慢性期に上昇し、脱髄領域への一時的なシュワン細胞の移動と再ミエリン化修復過程を示唆しました。

生物情報学ツール分析により、EVs中の星状膠細胞、小膠細胞、成熟ニューロンからのタンパク質の寄与が減少し、小膠細胞前駆細胞およびミクログリアからの寄与が増加したことが予測されました。検証分析では、安定状態のミクログリアに関連する標識タンパク質(TMEM119、P2RY12など)がEAEで下方調節され、炎症関連のミクログリアマーカーが上昇し、ミクログリアがプロ炎症性表型に変化したことが示されました。

ミエリン変化に対応して、EVs中のニューロンの成熟分化およびシナプス経路に関連するタンパク質もEAEの進行に伴い減少し、特に抑制性シナプスに関連するタンパク質は興奮性シナプスタンパク質よりも顕著に減少しました。さらに分析では、EVs中の前シナプスタンパク質は後シナプスタンパク質よりも顕著に減少しました。

MS血漿EVsのバイオマーカーとの関連

既存の研究では、多発性硬化症患者の血漿EVsにいくつかの炎症関連の潜在的なバイオマーカーが存在することが示されています。興味深いことに、本研究でもEAEマウス脊髄EVs中の多くのこれらのバイオマーカーの変化が観察されました。例えば、補体タンパク質、T細胞関連タンパク質(CD4など)、凝固カスケードタンパク質(フィブリノーゲンなど)、およびトール様受容体とその補助受容体などが含まれており、EVsがEAEおよびMSにおいて共通の病理的役割を果たす可能性がさらに示唆されました。

討論

本研究では、EAEマウス脊髄由来EVsの物理的特性およびタンパク質の構成における変化を系統的に特定し、MSモデルにおけるEVsの役割について新しい洞察を提供しました。EAEの過程でEVsのプロテオームが動的に変化し、CNSにおける重要な病理過程(局所炎症、脱/再ミエリン化、およびシナプス病理)を反映し、EVsがこれらの過程を調節する可能性が示唆されました。また、以前の研究でMS患者の血漿EVs中に発見されたいくつかの炎症関連EVバイオマーカーがEAEマウスの脊髄EVs中でも変化することが観察され、EVsがEAEおよびMSにおける病理過程に共通性があることが示されました。また、EVsのプロテオームの変化がCNSおよび末梢循環である程度重複していることも示されました。

本研究は、MS/EAEの病因解明におけるEVsの役割を明らかにするための新しい手がかりを提供し、将来のEVs関連バイオマーカー研究およびターゲット治療の基礎を築きました。なお、EVsの分離纯化および分析には依然として技術的な課題が存在し、今後の研究ではさらに正確な分析手法を探求する必要があります。また、将来の研究では特定の細胞由来EVsの機能性意義をさらに探求する必要があります。