β-ヒドロキシ酪酸は、グルコース欠乏状態のHMC3ヒトミクログリア様細胞の酸化還元状態、サイトカイン生成、および食作用能力を改善します

神経内科学 生化学 生命科学 免疫学 医学 細胞生物学
β-ヒドロキシ酪酸 HMC3 サイトカイン グルコース欠乏 ヒトミクログリア 食作用

研究報告：β-ヒドロキシ酪酸塩が糖欠乏状態のHMC3ヒトミクログリア細胞の還元状態、サイトカイン分泌、および貪食能力を改善する

序論

ミクログリアは脳内の常在性神経免疫細胞で、全神経膠細胞の5-12%を占め、強い遊走能、増殖能、貪食能を持っています。例えば、ミクログリアは脳実質内のアポトーシス細胞残骸を貪食することで健康な脳微小環境を維持します。中枢神経系の感染や損傷の場合、ミクログリアは損傷部位に遊走し、侵入した病原体や死細胞の破片を貪食し、炎症性サイトカイン、走化性因子、成長因子を放出して損傷組織の回復を助けます。ミクログリアは複雑な機能的多様性を示しますが、グルコース代謝の障害がどのようにその機能に影響するかは明らかではありません。グルコース代謝障害は、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、物質使用障害、不安、うつ病など、ほぼすべての神経変性疾患および精神疾患で一般的です。糖尿病患者もインスリン治療中に一時的な低血糖を経験することがあります。グルコース欠乏がミクログリア機能に与える影響を理解することは、これらの疾患のメカニズム研究と治療に重要な意味を持ちます。

論文の出典

本論文はAnil Kumar Rana、Babita Bhatt、Mohit Kumarらによって執筆され、National Agri-Food Biotechnology InstituteとRegional Centre for Biotechnologyに所属しています。本論文は2024年の「Journal of Neuroimmune Pharmacology」に掲載されました。DOIは10.1007/s11481-024-10139-5です。

研究のワークフロー

本研究では、in vitroで培養したヒトミクログリア細胞株HMC3を用いて、グルコース欠乏条件下での表現型状態、還元状態、サイトカインの分泌、貪食能力の変化を調べました。さらに、β-ヒドロキシ酪酸塩（BHB）を代謝補助として使用し、これらの特性の回復効果を探りました。

実験設計と方法

  1. 細胞培養と処理：

    • HMC3細胞は高グルコース（25mM）DMEMで培養し、10%（v/v）ウシ胎児血清（FBS）と1%（v/v）ペニシリン・ストレプトマイシン抗生物質を添加しました。
    • 80–90%の密集度に達した後、細胞を新しい高グルコースDMEMに置換し、24時間培養しました。グルコース欠乏とBHB補充実験では、無グルコースDMEMと5mM BHBを添加した無グルコースDMEMで細胞を24時間培養しました。

  2. MTTアッセイ：

    • MTT還元はNAD(P)H依存性酸化還元酵素に依存し、酸化的リン酸化とペントースリン酸経路活性の直接的な指標です。実験では細胞の酸化的リン酸化レベルを検出し、グルコース欠乏が細胞代謝活性に与える影響を検証しました。

  3. 亜硝酸塩レベルの測定：

    • Griess試薬を使用して、異なる条件下での細胞の亜硝酸塩レベルを検出し、細胞の還元状態を評価しました。

  4. 細胞死アッセイ：

    • トリパンブルー染色法を用いて細胞死を研究しました。トリパンブルー染色剤は完全な細胞膜を通過できず、負電荷の染料に排除されますが、損傷した死細胞には入ることができます。

  5. スーパーオキシドレベル：

    • ジヒドロエチジウム（DHE）染料を使用して、異なる条件に曝露された後の細胞のスーパーオキシドレベルを検出し、細胞の抗酸化ストレス状態を評価しました。

  6. ミトコンドリア染色：

    • MitoTracker™赤色染料を使用して細胞のミトコンドリア健康状態を評価しました。

  7. 定量PCR：

    • 定量的逆転写PCR（qPCR）を用いて遺伝子のmRNA発現を分析しました。

  8. 酵素結合免疫吸着測定（ELISA）：

    • 正常およびグルコース欠乏条件下でのHMC3細胞によるTNF、IL-1β、IL-6、IL-10などのサイトカインレベルを定量的に検出するために使用しました。

  9. 貪食アッセイ：

    • 蛍光標識ラテックスビーズを貪食基質として使用し、異なる処理条件下での細胞の貪食能力を評価しました。

  10. ウェスタンブロット：

    • 正常およびグルコース欠乏条件下でのHMC3細胞におけるNox2、BDH1、SCOTなどのタンパク質発現レベルを検出しました。

研究結果

  1. グルコース欠乏がエネルギー代謝と還元状態に与える影響：

    • MTTアッセイの結果、グルコース欠乏によりHMC3細胞の代謝活性が著しく低下し（p＜0.0001）、ミトコンドリアの健康状態も損なわれました（Mitotracker染色の減少）。細胞死は観察されませんでしたが（トリパンブルー染色）、全体的なエネルギー代謝と酸化還元状態が損なわれました。
    • グルコース欠乏条件下で細胞のNox2 mRNA発現が上昇しましたが（p=0.007）、タンパク質レベルは低下しました。さらに、スーパーオキシドと亜硝酸塩レベルも著しく低下し、グルコース欠乏条件下での細胞の抗酸化ストレス能力の低下を示しました。

  2. グルコース欠乏がサイトカイン分泌に与える影響：

    • qPCR分析の結果、グルコース欠乏条件下でIL-1β mRNA発現が上昇し（p=0.0009）、TNF mRNA発現が著しく低下しました（p=0.0009）。IL-6 mRNA発現に明らかな変化はありませんでした。
    • ELISAの結果、グルコース欠乏条件下でIL-1βとTNFの分泌が減少し、IL-6とIL-10の分泌に有意な変化がないことがさらに確認されました。

  3. グルコース欠乏が貪食能力に与える影響：

    • qPCR分析により、グルコース欠乏条件下でTREM2（p=0.016）とCD68（p=0.0006）のmRNA発現が著しく上昇することがわかりました。しかし、機能的貪食実験（ラテックスビーズ）では、グルコース欠乏が細胞の貪食活性を著しく低下させることが示されました。

  4. BHB補充の回復効果：

    • BHB補充により、グルコース欠乏HMC3細胞のIL-1β分泌（p=0.0328）と貪食活性（p=0.0261）が著しく回復しました。
    • メカニズム的には、BHB補充によりBDH1タンパク質発現が増加しました（p=0.0423）が、SCOT発現に有意な変化はありませんでした。さらに、BHB補充はミトコンドリアの健康状態を改善しました（MTT還元レベルが著しく上昇、p＜0.0001）。

結論

本研究は、グルコース代謝障害がミクログリアの貪食能と神経免疫機能に影響を与え、神経系疾患における病理学的変化を悪化させる可能性があることを示しています。ケトン体（BHBなど）の補充は、代替エネルギー源として機能し、グルコース欠乏条件下でのミクログリアのエネルギー代謝、還元状態、サイトカイン分泌、貪食能力を回復させることができます。したがって、BHBはこれらの病理学的状態を改善するための潜在的な代謝療法として機能する可能性があります。将来的には、より複雑なin vivo環境でこれらの発見を検証するためのさらなる研究が必要です。

研究のハイライト

  • ヒトHMC3ミクログリア細胞におけるグルコース欠乏のエネルギー代謝、還元状態、サイトカイン分泌、貪食能力への影響を初めて詳細に探究しました。
  • グルコース欠乏がミクログリアの代謝活性と抗酸化ストレス能力を著しく低下させ、サイトカイン分泌と貪食機能も弱めることを発見しました。
  • BHB補充を代替エネルギー源として提案し、グルコース欠乏条件下でのミクログリア機能を効果的に回復できることを示しました。