CD8+ T細胞サブセットの虚血性脳卒中後の神経炎症における長期的役割

背景紹介

虚血性脳卒中は死亡と障害の主要な原因の1つです。脳卒中発生後、神経炎症が急速に誘発され、マスト細胞、アストロサイト、ミクログリア、血管内皮細胞などの様々な細胞が活性化されます。これらの反応性細胞は続いて多様な炎症メディエーターを発現し、白血球を脳病変の中心部と周辺領域に誘導します（Jayarajら、2019）。浸潤した白血球の中で、T細胞は特異的抗原依存性および非依存性の条件下で、脳卒中後の神経細胞損傷に無視できない役割を果たします（Selvaraj & Stowe、2017；Zhangら、2021）。以前の研究では、亜急性期（48時間から7日）および後期段階（>7日）におけるT細胞の傷害側脳への移動と存在が、脳卒中後の神経炎症に著しい影響を与えることが示されています（Lieszら、2013；Shiら、2021）。

最近の研究では、脳外傷後のCD8+ T細胞の長期蓄積が神経細胞の長期的損傷をもたらすことが発見され（Daglasら、2019）、CD8+ T細胞の遅延除去が脳卒中後の機能回復を改善できることが示されています（Selvarajら、2021）。しかし、これらのT細胞サブセットが脳卒中後の神経炎症で果たす具体的な役割はまだ明確ではありません。本論文はこの研究の空白を埋め、CD8+ T細胞サブセットが脳卒中後の長期的な神経炎症で果たす潜在的な役割を探索しました。

論文の出典

本論文の著者はLong Shu、Hui Xu、Jiale Ji、Yuhan Xu、Ziyue Dong、Yuchen WuとYijing Guoで、それぞれ東南大学中大病院神経内科と中国三峡大学附属仁和病院神経内科に所属しています。本論文は2024年4月9日に『Neuromolecular Medicine』誌に受理され、2024年第26巻第17ページに掲載されました。

研究プロセス

本研究ではC57BL/6Jマウスを実験対象とし、一過性中大脳動脈閉塞（tmcao）モデルを確立しました。実験プロセスには以下の手順が含まれます：

1. tmcaoモデルの確立：

   • マウスは2.0%イソフルラン吸入麻酔下で手術を行い、シリコンコーティングされた単繊維を左内頸動脈から中大脳動脈起始部まで進め、90分間閉塞しました。手術全過程で脳血流量（CBF）をモニタリングし、これが手術成功の基準となりました。
   • 術後、マウスは2つのグループに分けられました：第1グループは術後3日目に脾臓細胞と傷害側の免疫細胞を採取し、第2グループは術後30日目に同様の処理を行いました。

2. 免疫細胞の採取と処理：

   • マウスはCO_2で安楽死させ、心臓灌流を行って循環血細胞を除去しました。脾臓と傷害側の脳を小片に切り、消化しました。消化後の単細胞懸濁液はリンパ球分離液を用いて分離し、後続の実験に使用しました。

3. フローサイトメトリー分析：

   • 採取した細胞の表面マーカーと細胞内タンパク質を染色し、BD LSR iiフローサイトメーターを使用して細胞を分析し、CD8+ T細胞サブセットを分離しました。細胞の初期活性化はPMAとイオノマイシンの添加により行われました。

4. RNA抽出とリアルタイムPCR：

   • RNA抽出キットを使用して総RNAを抽出し、逆転写してcDNAを合成した後、リアルタイムPCRにより炎症メディエーターの転写レベルを定量化しました。

5. 共培養実験：

   • CD8+ T細胞サブセットのミクログリアへの影響を検証しました。分離したCD8+ T細胞サブセットを正常マウス脳のCD45lowCD11b+ミクログリアと24時間共培養し、その後共培養ミクログリアのRNAを抽出してリアルタイムPCR分析を行いました。

6. 免疫蛍光イメージング：

   • 免疫蛍光標識を用いて、脳組織切片と培養ミクログリアにおけるCD8+ T細胞とGFAP（アストロサイトマーカー）の発現を検証しました。

研究結果

CD8+ T細胞の長期存在

術後3日目と30日目に脾臓と傷害側脳から免疫細胞を採取しました。結果は、時間の経過とともに傷害側脳のCD8+ T細胞数が著しく増加し、主に梗塞周辺領域に集中していることを示しました。

サイトカイン発現

フローサイトメトリー分析により、術後3日目の脾臓のCD8+ T細胞はほとんどIFN-γとIL-17Aを発現していないことが分かりましたが、30日目の脾臓のCD8+ T細胞は主にIFN-γを産生していました。術後3日目の傷害側脳のCD8+ T細胞も主にIFN-γ産生細胞でしたが、術後30日目では、傷害側脳のCD8+ T細胞にはIFN-γ+ / IL-17A+二重陽性細胞が含まれていました。

傷害側脳におけるTC1およびTC17細胞の同定

さらなる分析により、TC1細胞が術後3日目の傷害側脳に既に存在していることが示され、30日目にはIL-17A陽性のTC17細胞およびIFN-γとIL-17A二重陽性のTC17/1細胞も検出されました。

生体TC1、TC17およびTC17/1細胞の識別と濃縮

研究では既知のケモカイン/サイトカイン受容体マーカーを用いて、術後30日目に傷害側脳からTC1、TC17およびTC17/1細胞を成功裏に同定および分離しました。TC1細胞はCD8+ CCR6- CXCR3+細胞として、TC17細胞はCD8+ CCR6hi CXCR3-/lo CCR4+ IL-23R+細胞として、TC17/1細胞はCD8+ CCR6int CXCR3+CCR4+ IL-23R+細胞として定義されました。

TC17/1細胞がミクログリアで最強の炎症反応を誘導

共培養実験により、3種類のCD8+ T細胞サブセットすべてがミクログリアを活性化し、炎症メディエーターの発現を誘導できることが示されました。そのうち、TC17/1細胞が最強の誘導効果を持っていました。

研究結論

本研究は、CD8+ T細胞サブセット（TC1、TC17およびTC17/1細胞を含む）が脳卒中後の長期的な神経炎症で果たす潜在的な役割を初めて明らかにしました。これらの細胞サブセット、特にTC17/1細胞は、ミクログリアを活性化することで、脳卒中後の慢性神経炎症において重要な役割を果たす可能性があり、したがって将来の脳卒中治療の新たな標的となる可能性があります。

研究のハイライト

1. 初の発見：TC1、TC17およびTC17/1細胞の脳卒中後の脳における長期的な存在と役割を初めて報告しました。
2. 細胞識別：生体のTC1、TC17およびTC17/1細胞の識別と濃縮に成功し、そのマーカー発現を検証しました。
3. 機能検証：共培養実験を通じて、これらの細胞サブセットがミクログリアの活性化と炎症反応の誘導において果たす異なる役割を検証し、TC17/1細胞が最強の誘導効果を持つことを発見しました。

本研究は脳卒中後の長期的な神経炎症プロセスの理解を深め、新たな治療経路を示唆しました。将来の研究では、これらの細胞サブセットの起源、動的変化、および他の神経細胞や機能回復への影響をさらに探索する必要があります。