催乳素释放肽通过G蛋白偶联受体识别和传导信号的分子机制
解析PRRP和PRRPR的分子识别及信号传导机制
研究背景
神经肽作为神经系统中最丰富的信号分子，已识别出超过100种，其在代谢、痛觉、繁殖等生理过程中起着至关重要的作用。其中，RF-酰胺类神经肽以其C末端的Arg-Phe-NH₂（RF-酰胺）基序为特征，包括催乳素释放肽（PRRP）、神经肽FF（NPFF）、亲吻肽（Kisspeptin）等。RF-酰胺神经肽通过与特定G蛋白偶联受体（GPCR）结合，调控广泛的生理功能。然而，尽管PRRP及其受体PRRPR在调节压力、食欲、疼痛和心血管功能等方面具有重要意义，其与受体结合及活化的分子机制仍未被完全阐明。
PRRP是一种高度保守的RF-酰胺神经肽，其通过逆向药理学研究被鉴定为PRRPR的内源性配体。PRRP与PRRPR主要通过Gq/11信号通路传导信号，同时也可能激活Gi/o通路。然而，现有关于PRRP与PRRPR的结构及其相互作用研究较为有限，这限制了对其功能机制的深入理解。为此，本研究通过冷冻电子显微镜（Cryo-EM）揭示了PRRP与PRRPR结合并激活Gq和Gi异三聚体的结构，为开发选择性药物提供了结构基础。
研究来源
本文发表于《Cell Discovery》，由中国科学院上海药物研究所、中国科学院大学、南京中医药大学及上海交通大学等多家机构的研究人员联合完成。主要作者包括Yang Li、Qingning Yuan等，通讯作者为H. Eric Xu和Li-Hua Zhao。本研究通过揭示PRRP和PRRPR相互作用的关键结构特征，为神经肽-受体系统的机制研究及药物开发奠定了基础。
研究方法
1. 研究流程
研究人员首先通过构建和表达PRRPR的全长野生型受体，并引入标签和小分子探针，以促进GPCR-G蛋白复合物的稳定性。随后，利用Cryo-EM技术解析了PRRP20（20氨基酸的PRRP活性异构体）与PRRPR结合后激活Gq和Gi的复合物结构，分辨率分别为2.96 Å和2.97 Å。此外，还通过分子动力学（MD）模拟和功能实验分析了不同复合物的结合能、柔性及活化特征。
2. 关键实验技术
- 复合物制备：采用昆虫细胞表达体系共同表达PRRPR及其配体，利用亲和纯化、分子筛柱分离等技术获得高纯度的复合物样品。
- 冷冻电镜分析：在液氮环境中冷冻样品，通过Titan Krios G4电镜采集Cryo-EM数据，并利用深度学习增强和分子建模重建分子结构。
- 分子动力学模拟：构建PRRPR-Gq/Gi复合物模型，进行200 ns的模拟以研究配体结合和受体活化的动态行为。
- 功能验证：通过BRET2实验分析PRRP20诱导的Gq和Gi解离效率，并通过突变实验验证关键氨基酸对信号传导的作用。
研究结果
1. PRRP20与PRRPR结合的关键结构
PRRP20呈L形构象，其C末端的RF-酰胺基序插入PRRPR的配体结合袋中。结构分析表明，PRRP20的C末端与PRRPR形成多个极性和疏水相互作用网络，关键氨基酸包括C113².⁵⁷、T117².⁶¹、Q141³.³²和H321⁷.³⁹等。这些相互作用对于PRRP20的高亲和力至关重要。此外，R19和F20的保守性表明其在不同RF-酰胺配体受体中具有普遍重要性。
2. PRRPR的激活机制
PRRPR的活化伴随着跨膜区TM6的外移及TM7的内移，这些构象变化通过信号传导至胞内区并耦合G蛋白。F20通过与Q141³.³²的极性相互作用，触发TM3的构象变化并进一步激活PRRPR。研究还揭示了PRRPR独特的激活路径，Y146³.³⁷通过与TM5的相互作用促进了TM6的运动，这一机制区别于其他GPCR受体。
3. PRRPR与Gq/Gi的选择性耦合
PRRPR与Gq和Gi的耦合显示出显著的构象差异，尤其是在TM6及Gα亚基α5螺旋的相对位置上。Gq更倾向于耦合PRRPR，可能与其α5螺旋“波钩”区域的独特极性网络有关。突变实验进一步证实了这些相互作用对于信号选择性的重要性。
研究意义
本研究通过高分辨率Cryo-EM结构揭示了PRRP与PRRPR结合及信号传导的分子机制，为神经肽-受体系统的选择性药物开发提供了结构基础。这些发现不仅加深了对RF-酰胺类神经肽识别机制的理解，还为调控食欲、压力和疼痛等相关疾病的治疗策略设计提供了新思路。此外，本研究的创新性方法学对其他GPCR研究也具有重要参考价值。
研究亮点
- 揭示了PRRP20与PRRPR结合的分子细节，提供了RF-酰胺基序识别的普遍机制。
- 阐明了PRRPR的独特活化路径及其与其他GPCR的差异。
- 提供了PRRPR与Gq/Gi选择性耦合的结构基础，有助于开发选择性药物。
本研究不仅填补了PRRPR结构研究的空白，还为未来的GPCR机制研究和药物设计提供了宝贵的资源。